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　　染色凋亡試劑盒原理：

　　磷脂酰絲氨*（PS）在正常細(xì)胞中只存在于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，而在凋亡早期，PS由細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)外翻至細(xì)胞膜外側(cè)。Annexin V-PI染色凋亡試劑盒是一種分子量為35-36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS特異性結(jié)合。AnnexinⅤ經(jīng)過FITC、EGFP或PE標(biāo)記后，作為熒光探針，即可通過PS特異性結(jié)合從而特異性標(biāo)記凋亡早期細(xì)胞。

　　Propidium iodide（PI）是一種核酸染料，但其不能通過活細(xì)胞的完整細(xì)胞膜，只能通過凋亡晚期和死細(xì)胞的細(xì)胞膜，因此只能用來標(biāo)記凋亡晚期細(xì)胞和死細(xì)胞。

　　通過AnnexinⅤ與PI聯(lián)合標(biāo)記，再經(jīng)流式細(xì)胞儀或者熒光顯微鏡檢測，就可以確定細(xì)胞是活細(xì)胞、凋亡早期細(xì)胞還是凋亡晚期細(xì)胞或者死細(xì)胞。

　　試劑盒組成

　　A液（Annexin V-EGFP）、B液（PI溶液）、Binding Buffer

　　染色凋亡試劑盒實驗步驟：

　　1. 懸浮細(xì)胞處理：收集細(xì)胞懸液，900rpm 3min離心去除培養(yǎng)基后用PBS潤洗2次，再用Binding Buffer將細(xì)胞重懸為1x106個/ml的細(xì)胞懸液。

　　貼壁細(xì)胞處理：將細(xì)胞消化下來吹散后，離心去除胰m及培養(yǎng)基后用PBS潤洗2次，再用Binding Buffer將細(xì)胞重懸為1x106個/ml的細(xì)胞懸液。

　　2. 取100ul細(xì)胞懸液加入5ul A液與5ul B液，混勻后避光孵育10min。

　　3. 用熒光顯微鏡或者流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果。

　　染色凋亡試劑盒注意事項：

　　1. 必須使用活細(xì)胞進行檢測，不能使用破壞細(xì)胞膜完整性的試劑處理細(xì)胞。

　　2. 普遍認(rèn)為PI有潛在致癌風(fēng)險，操作時注意戴手套操作，避免交叉污染。

　　3. 孵育結(jié)束后，應(yīng)盡量在1h以內(nèi)檢測結(jié)果，否則結(jié)果可能出現(xiàn)異常。

　　4. 細(xì)胞經(jīng)過消化、離心、清洗后可能會出現(xiàn)凋亡增多的情況，因此必須注意操作盡量輕柔，離心轉(zhuǎn)速和時間盡量低，尤其是貼壁細(xì)胞不要消化時間過長導(dǎo)致細(xì)胞提前進入凋亡。

　　5. AnnexinⅤ是Ca2+依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，因此消化細(xì)胞時盡量不要使用含EDTA的消化液，PBS也不要含EDTA等螯合劑。

　　6. 使用熒光顯微鏡檢測時，可以將貼壁細(xì)胞直接接種在玻片上，實驗時對細(xì)胞進行清洗染色后直接在玻片上觀察細(xì)胞，避免消化損失細(xì)胞導(dǎo)致凋亡率增加。

　　使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞時，可以根據(jù)實驗需要設(shè)置陰性對照（未染色）、單染對照（Annexin V-EGFP、PI分別單染）以調(diào)整熒光補償去除光譜重疊，同時根據(jù)未處理細(xì)胞空白對照和經(jīng)Annexin V、PI分別細(xì)胞染色后的單染對照的分析設(shè)定十字門的位置。

熒光顯微鏡下檢測效果