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武漢尚恩生物生產(chǎn)的支原體PCR檢測試劑盒（巢式PCR）采用巢式PCR法(Nested PCR)以提高支

原體檢測的靈敏度和和特異性?；驹硎?，先在支原體rRNA上的16S和23S上設(shè)
計一對引物，用于擴增部分16S-23S之間的保守區(qū)以及全部的其間間隔區(qū)，保守區(qū)
可以用于判斷是否存在支原體污染。

產(chǎn)品名稱	支原體PCR檢測試劑盒（巢式PCR）
貨號	SNCD-001
規(guī)格	250次（20ul體系）
簡介	支原體（Mycoplasma）別名霉形體，直徑0.1-0.3um，具有高度多樣性，是一種沒有細胞壁、可以用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖的最小的原核生物。其廣泛存在于人和動物體內(nèi)，大多數(shù)不致病。由于其廣泛存在，外加體積較小可以通過濾膜混入細胞培養(yǎng)體系，也很難通過普通光鏡觀察到，普通抗生素對其也沒有有效的抑制作用，因此成為細胞培養(yǎng)中比較常見而且難以檢測清除的污染。 支原體污染對細胞會有多方面的影響，包括以下方面：1.細胞生長速度改變；2.細胞形態(tài)、狀態(tài)改變；3.細胞染色體異常、突變甚至功能改變；4.細胞對環(huán)境沖擊耐受力降低；5.相關(guān)細胞實驗獲得的數(shù)據(jù)異常等?？梢哉f對細胞及細胞相關(guān)實驗有極其嚴重的影響，因此檢測及清除廣泛存在的支原體污染成為諸多實驗室必須要經(jīng)歷的過程。 支原體污染無法通過肉眼或者普通光鏡直接判斷，只能通過各種試劑、儀器檢測。支原體常規(guī)檢測方法有：熒光法、培養(yǎng)法、電鏡法、常規(guī)PCR法、一步PCR法、化學(xué)發(fā)光法等，不同檢測方法能夠檢測的支原體種類不同，其檢測靈敏度、特異性、便捷性也有各自的特點。 本公司生產(chǎn)的支原體PCR檢測試劑盒采用巢式PCR法(Nested PCR)以提高支原體檢測的靈敏度和和特異性?；驹硎?，先在支原體rRNA上的16S和23S上設(shè)計一對引物，用于擴增部分16S-23S之間的保守區(qū)以及全部的其間間隔區(qū)，保守區(qū)可以用于判斷是否存在支原體污染，因此初次PCR產(chǎn)物即可初步判定是否存在支原體污染；其次，在23S和間隔區(qū)設(shè)計第二對引物，保證第二對引物目標(biāo)序列在第一對引物目標(biāo)序列之內(nèi)，形成巢式結(jié)構(gòu)，然后使用第二對引物對初次PCR的產(chǎn)物進行二次擴增，可以大大提高檢測的特異性和靈敏度。原理圖如下：
使用方法	1.客戶需要自備的試劑、儀器 <1>待檢測樣品：細胞上清、血清或者培養(yǎng)基、細胞DNA。 細胞上清建議使用培養(yǎng)細胞3-5天的上清，培養(yǎng)時間過短的上清支原體含量較低可能無法有效檢出，血清或者培養(yǎng)基也應(yīng)在培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)1-2天使支原體有一定程度增殖再用于檢測；細胞懸液無法直接用于檢測，需要提取總DNA后檢測，添加量為PCR體系的1/20或更少。 <2>儀器、試劑 a.PCR相關(guān)：PCR儀、無菌PCR管、微量離心機 b.電泳相關(guān)：瓊脂糖凝膠、電泳儀、電泳緩沖液、DNA marker、DNA染色液 c.通用：移液器、無菌Tip頭、離心管等 2.實驗步驟 <1>1st PCR a.按以下表格加入各反應(yīng)試劑 b.1st PCR反應(yīng)參數(shù)： STEP1 (起始變性): 94oC 30sec STEP2 (變性): 94oC 30sec STEP3 (退火): 55oC 2min STEP4 (延伸): 72oC 1min STEP5 (循環(huán)): Go To STEP2 for 30 cycles STEP6 (最終延伸): 72oC 5min STEP7 (臨時保存): 4oC forever <2>2nd PCR a.按以下表格加入各反應(yīng)試劑 b.2nd PCR反應(yīng)參數(shù)： STEP1 (起始變性): 94oC 30sec STEP2 (變性): 94oC 30sec STEP3 (退火): 55oC 2min STEP4 (延伸): 72oC 1min STEP5 (循環(huán)): Go To STEP2 for 30 cycles STEP6 (最終延伸): 72oC 5min STEP7 (臨時保存): 4oC forever 3.結(jié)果檢測 <1>取2次PCR產(chǎn)物各10uL，通過瓊脂糖凝膠電泳并染色觀察目的條帶。由于不同類型的支原體擴增出來的條帶大小不一，因此通過條帶大小可以粗略判斷支原體類型，如需要進一步檢測確定，建議對產(chǎn)物進行測序比對。 <2>結(jié)果示例 2nd產(chǎn)物    1st 產(chǎn)物    Marker
產(chǎn)品組分
存儲條件	-20℃（避免反復(fù)凍融）
保質(zhì)期	-20℃一年（避免反復(fù)凍融）

注意事項：
1.該產(chǎn)品-20度可以保存一年以上，但反復(fù)凍融或保存不當(dāng)可能會導(dǎo)致引物或陽性對照失效，如需多次使用，建議小量分裝。
2.該試劑盒確認可以檢測Mycoplasma arginini 、Mycoplasma arthritidis  等12種支原體，但無法檢測人肺炎支原體。
3.該產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于診斷或臨床實驗。