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推“柱”之薦｜配方顆粒色譜柱推薦之魚(yú)腥草
在前幾期，我們?yōu)榇蠹医榻B并推薦了適用于中草藥檢測(cè)的各類安捷倫色譜柱，以便大家在日后的檢測(cè)工作中匹配使用。本期繼續(xù)帶來(lái)適用于魚(yú)腥草配方顆粒檢測(cè)的色譜柱推薦，跟上我們，精彩繼續(xù)！
Agilent TC 和 HC C18 系列是 2005 年推出通用 HPLC 色譜柱，采用高純硅膠、專有的鍵合及封端技術(shù)，具有較高的碳載量、比表面積和惰性表面；TC（2） 和HC（2） 為該系列的第二代產(chǎn)品，在硅膠去活、封端工藝方面做了優(yōu)化，更有利于堿性化合物的分離和峰形改善。TC/ HC 系列在中藥分析中有大量應(yīng)用，配方顆粒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用統(tǒng)計(jì)點(diǎn)擊這里。
根據(jù)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局 《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)》中魚(yú)腥草配方顆粒的檢測(cè)項(xiàng)目，對(duì)其特征譜圖和含量測(cè)定都采用 HPLC 方法。特征譜圖及含量測(cè)定中要求理論板數(shù)按槲皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于 3000。由于特征圖譜的分析時(shí)間為 80 分鐘，含量測(cè)定的時(shí)間也接近 20 分鐘，耗時(shí)太長(zhǎng)，儀器利用率很低，檢測(cè)效率低下。本文先采用 Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱重現(xiàn)了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，再使用 ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD, 2.1x100mm, 1.8μm 色譜柱，進(jìn)行方法轉(zhuǎn)換，在 1290 Infinity II 超高效液相色譜儀上實(shí)現(xiàn)了魚(yú)腥草配方顆粒的特征譜圖和含量測(cè)定 UHPLC 方法建立。
1 特征譜圖
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
圖 1. 魚(yú)腥草配方顆粒國(guó)標(biāo)對(duì)照譜圖與替代方法中供試品特征譜圖(包括 HPLC 方法和 UHPLC 方法)的比較 （峰 1：新綠原酸；峰 2(S)：綠原酸；峰 3：隱綠原酸；峰 5：金絲桃苷；峰 6：槲皮苷）
由于峰 4 沒(méi)有對(duì)照品，本實(shí)驗(yàn)比較了該峰在方法轉(zhuǎn)換前后的光譜圖，其光譜一致，見(jiàn)圖 2 所示。
圖 2. 方法轉(zhuǎn)換前后峰 4 的光譜對(duì)比
色譜條件：
標(biāo)準(zhǔn)方法：
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流動(dòng)相：A：乙腈；B：H2O（0.1%磷酸）
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梯度：0-10 min，94 %-92%B；10-25 min，92%B-85%B；25-30min,85-84%B；30-45min，84-82%B；45-55min，82-73%B；55-75min，73-73%B；75-80min，73-94%B；后運(yùn)行，7min
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流速：1mL/min
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柱溫：30 °C
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檢測(cè)波長(zhǎng)：0~30分鐘為326nm，30~80分鐘為254nm(采樣頻率：2.5Hz)
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進(jìn)樣量：10 μL
轉(zhuǎn)換后的UHPLC方法：
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梯度：0-1.5 min，94 %-92%B；1.5-3.8 min，92%B-85%B；3.8-4.5min,85-84%B；4.5-6.8min，84-82%B；6.8-8.3min，82-73%B；8.3-12min，73-73%B；12-12.5min，73-94%B；后運(yùn)行，3min
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流速：0.6ml/min
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柱溫：30 °C
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檢測(cè)波長(zhǎng)：0~4.5分鐘為326nm，4.5~12.5分鐘為254nm(采樣頻率：20Hz)
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進(jìn)樣量：1 μL
系統(tǒng)適用性結(jié)果見(jiàn)下表：
結(jié)果
1）使用 Agilent TC-C18 色譜柱，峰 1，3，4 的相對(duì)保留時(shí)間（RRT）和峰 5、6 的相對(duì)峰面積滿足標(biāo)準(zhǔn)要求，能重現(xiàn)國(guó)標(biāo)方法中的特征圖譜。
2）使用 ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 UHPLC 色譜柱，峰 4 的 RRT 超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)要求的 10%, 但通過(guò)光譜顯示，UHPLC 方法中峰 4 的光譜與 HPLC 方法中保持一致，綜合研判，應(yīng)為同一物質(zhì)。
3） 轉(zhuǎn)換成 UHPLC 方法后，分析時(shí)間縮短至 HPLC 方法的 16%。
2 含量測(cè)定
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
圖 3. 魚(yú)腥草配方顆粒供試品含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)方法和 UHPLC 方法譜圖對(duì)照
色譜條件：
標(biāo)準(zhǔn)方法：
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流動(dòng)相：A：乙腈；B：H2O（0.1%磷酸）
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比例：A：B=23：77
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流速：1mL/min(HPLC),0.6 mL/min(UHPLC)
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柱溫：30 °C
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檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm(4nm)；采樣頻率：2.5Hz(HPLC), 20Hz (UHPLC)
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進(jìn)樣量：10 μL(HPLC), 1 μL(UHPLC)
系統(tǒng)適用性及檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)下表：
結(jié)果
1）使用 TC-C18 柱測(cè)定供試品中槲皮苷的含量，其理論板數(shù)符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。
2）通過(guò) UHPLC 方法轉(zhuǎn)換，系統(tǒng)適應(yīng)性結(jié)果滿足要求，檢測(cè)效率提高 5 倍。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)選用 TC-C18 HPLC 色譜柱，重現(xiàn)了魚(yú)腥草配方顆粒特征譜圖及含量測(cè)定方法，均符合標(biāo)準(zhǔn)要求。通過(guò) UHPLC 方法轉(zhuǎn)換后，使用 ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD 色譜柱，系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)、含量檢測(cè)結(jié)果與 HPLC 結(jié)果一致，檢測(cè)效率大大提高。
儀器系統(tǒng)及色譜柱推薦
1260 Infinity II 四元 HPLC 系統(tǒng)：四元泵(G7111B)，自動(dòng)進(jìn)樣器(G7129A)，柱溫箱(G7116A)，VWD(G7114A)
1290 Infinity II 四元 UHPLC 系統(tǒng)：全能泵(G7104A)，自動(dòng)進(jìn)樣器(G7129B)，柱溫箱(G7116B)，DAD(G7117A)
其它詳細(xì)操作可以參考 Agilent 配方顆粒圖譜集，或聯(lián)系 Agilent。