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基于UHPLC/MSD檢測(cè)抗體制劑中游離脂肪酸的含量
研究背景
由于吐溫（聚山梨酯，polysorbate）具有優(yōu)良的穩(wěn)定性、生物相容性和安全性，是抗體藥物制劑處方中常用的穩(wěn)定劑。作為制劑的重要輔料，吐溫既可以提高活性成分的溶解度，同時(shí)又可以抑制蛋白藥物的自動(dòng)聚合。盡管吐溫在多種生物制劑中被廣泛應(yīng)用，但由于不同供應(yīng)商家產(chǎn)品中存在的副產(chǎn)物差異以及其對(duì)各種降解反應(yīng)的敏感性，迫切需要合適的質(zhì)控方法來(lái)監(jiān)控吐溫原料當(dāng)中以及終端生物制品生命周期中的吐溫質(zhì)量。
在生物制劑配方的酸堿條件下或者具有脂肪酶/酯酶活性的殘存的宿主細(xì)胞蛋白（HCP）的催化作用下，吐溫可能發(fā)生水解，見(jiàn)圖 1。吐溫的降解不僅降低了表面活性劑的真實(shí)濃度，而且還與不溶性微粒的形成有關(guān)。中藥注射液和化學(xué)藥品注射液亦是常用吐溫作為增溶劑、乳化劑或分散劑，制劑通常也會(huì)根據(jù)主藥的化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行 pH 值的調(diào)節(jié)，弱的酸堿條件下同樣會(huì)導(dǎo)致吐溫的水解。吐溫原料本身的質(zhì)量也有較大的差異，同時(shí)在長(zhǎng)期的儲(chǔ)存和流通中也會(huì)產(chǎn)生不同程度的水解。
圖 1. 吐溫 20 水解示意圖
對(duì)吐溫原料及其相關(guān)的不同類型制劑中的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和安全性的關(guān)注促進(jìn)了吐溫表征和定量的分析方法的發(fā)展。安捷倫公司與科邁恩以及中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所合作建立了吐溫表征和檢測(cè)的系列方案，如 UHPLC/QTOF 結(jié)合 Polymer Studio 軟件用于吐溫組成和降解產(chǎn)物精細(xì)表征，詳細(xì)內(nèi)容可參考往期微信推送?；谟坞x脂肪酸結(jié)構(gòu)中無(wú)明顯發(fā)色基團(tuán)，并且抗體制劑中游離脂肪酸的含量較低，選擇了靈敏度高、專屬性強(qiáng)并且操作簡(jiǎn)單的單四極桿質(zhì)譜法來(lái)檢測(cè)游離脂肪酸。安捷倫實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用 ICH Q14 分析方法開(kāi)發(fā)指導(dǎo)原則的 AQbD（analytical Quality by Design）理念開(kāi)發(fā)了基于 UHPLC-MSD 單四極桿質(zhì)譜的游離脂肪酸含量測(cè)定方法。
儀器和設(shè)備
采用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)，配備如下：
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二元泵（部件號(hào) G7120A）
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自動(dòng)進(jìn)樣器（部件號(hào) G7167B）
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柱溫箱（部件號(hào) G7116B）
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單四極桿質(zhì)譜（部件號(hào) G6125C）
色譜柱 Agilent Zorbax SB-C18 2.1 ×50 mm, 1.8 μm
方法開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證
樣品前處理：操作簡(jiǎn)單，進(jìn)行簡(jiǎn)單的蛋白沉淀，離心取上清液過(guò)濾后直接進(jìn)樣分析。
色譜質(zhì)譜條件摸索：基于 ICH Q14 分析方法開(kāi)發(fā)指導(dǎo)原則，進(jìn)行色譜和質(zhì)譜條件的摸索，如下表所示
3 種游離脂肪酸典型分離色譜圖
方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果
分析方法色譜條件確定后，并按照 ICH Q2 的要求進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。
實(shí)際樣品色譜圖與含量
用開(kāi)發(fā)的方法對(duì)三個(gè)不同的抗體樣品中的游離脂肪酸進(jìn)行分析，具體結(jié)果如下：
結(jié)語(yǔ)
我們基于 ICH Q14 分析方法開(kāi)發(fā)指導(dǎo)原則的 AQbD 理念，利用 UHPLC/MSD 單四極桿質(zhì)譜和亞二微米 Zorbax SB-C18 色譜柱開(kāi)發(fā)了抗體藥物制劑中游離脂肪酸含量測(cè)定的方法，并按照藥典要求進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。本方法樣品基質(zhì)和流動(dòng)相無(wú)干擾，3 種游離脂肪酸線性相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù) R2 均大于 0.999，平均回收率處于 86.85%-105.33% 的范圍內(nèi)，回收結(jié)果良好。
本方法能快速準(zhǔn)確的檢測(cè)抗體制劑中游離脂肪酸的含量，監(jiān)控抗體制劑在運(yùn)輸、儲(chǔ)存和流通過(guò)程中吐溫由于酯酶或則 pH 作用導(dǎo)致的水解變化，為抗體制劑中吐溫降解的研究提供靈敏的檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)也可以用于化學(xué)藥物注射液、中藥注射液以及吐溫原料中吐溫水解產(chǎn)生的游離脂肪酸的含量，用于評(píng)估制劑生命周期中的吐溫的質(zhì)量。
# 掃碼可獲得詳細(xì)的《安捷倫蛋白制劑中可見(jiàn)異物/不溶性微粒整體方案》
參考文獻(xiàn)：
[1] 賈東辰，何伍，中國(guó)新藥雜志，2022，31（10）933-936.
[2] Maximilian N. Honemann, Jan Wendler, Tobias Graf, Anja Bathke, Christian H. Bell,
Journal of Chromatography B，1116 (2019) 1–8.