流式細(xì)胞力學(xué)測(cè)試分析

流式細(xì)胞力學(xué)測(cè)試分析       細(xì)胞力學(xué)測(cè)試分析系統(tǒng)

德國(guó)Zellmechanik公司

AcCellerator型

單細(xì)胞力學(xué)流式分析系統(tǒng)

研發(fā)背景

1 研究細(xì)胞力學(xué)在臨床有什么意義？ 如何區(qū)分不同果實(shí)的成熟度？

解決方案：施加適當(dāng)?shù)牧Σ⒏袘?yīng)水果的機(jī)械特性，將清楚地向您展示成熟和過熟的獼猴桃之間的區(qū)別。

這是否也適用于較小的水果組織碎片？如果我們下降到單細(xì)胞水平怎么辦？

細(xì)胞的機(jī)械特性由功能上重要的細(xì)胞成分控制，例如細(xì)胞骨架。它們構(gòu)成了一種新興的無(wú)標(biāo)記生物標(biāo)志物，可以直接了解細(xì)胞功能或功能障礙。因此，機(jī)械特性有助于理解和評(píng)估藥物治療效果、免疫細(xì)胞活化、干細(xì)胞分化、癌癥預(yù)后或培養(yǎng)細(xì)胞的狀態(tài)和質(zhì)量的評(píng)估。

   細(xì)胞變形能力與細(xì)胞的狀況和功能相關(guān)。

   無(wú)需標(biāo)記即可評(píng)估細(xì)胞變形能力。

   應(yīng)用潛力巨大。

細(xì)胞力學(xué)構(gòu)成了研究從發(fā)育到疾病的主題的關(guān)鍵科學(xué)目標(biāo)。

2 為什么采用單細(xì)胞流式分析？

Jochen Guck 教授在德累斯頓工業(yè)大學(xué)使用 AFM 和光學(xué)拉伸來(lái)揭示細(xì)胞力學(xué)與細(xì)胞功能（或功能障礙）之間的相關(guān)性。這些方法的一個(gè)主要障礙是低通量（多 100 個(gè)細(xì)胞/小時(shí)）。測(cè)量過程為：找到一個(gè)細(xì)胞，停止施力，整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后釋放細(xì)胞，分析測(cè)量參數(shù)。為了克服耗時(shí)的步驟，于是他們開發(fā)了一種使用具有連續(xù)力和動(dòng)態(tài)分析的連續(xù)流的方法：RT-DC。

Oliver Otto 博士和 Philipp Rosendahl 博士在 2013 年左右實(shí)施了這個(gè)想法。從那時(shí)起，已經(jīng)發(fā)表了許多具有高影響力的科學(xué)論文，并且技術(shù)開始普及。

現(xiàn)在可以同時(shí)測(cè)量細(xì)胞的物理特性和熒光信號(hào) (RT-FDC)，從而可以將細(xì)胞的物理特性與細(xì)胞生物學(xué)的黃金標(biāo)準(zhǔn)（熒光流式細(xì)胞術(shù)）進(jìn)行比較和關(guān)聯(lián)。近還可以沿通道動(dòng)態(tài)跟蹤細(xì)胞變形并研究變形的時(shí)間相關(guān)動(dòng)力學(xué) (dRT-DC)。

技術(shù)原理

1 如何高速的壓縮單個(gè)細(xì)胞？

為了產(chǎn)生確定的力，孤立的細(xì)胞被泵送通過橫截面略大于細(xì)胞橫截面的微通道。周圍流體的壓力梯度產(chǎn)生流動(dòng)剖面并使細(xì)胞流體動(dòng)力學(xué)變形。流體的流速和粘度控制作用在細(xì)胞上的力。

細(xì)胞可以通過流體動(dòng)力變形。

力由流速和粘度控制。

較軟的細(xì)胞顯示較大的變形。

RT-DC 中的“實(shí)時(shí)"來(lái)自于拍攝圖像時(shí)對(duì)細(xì)胞輪廓的即時(shí)分析。

細(xì)胞面積、高度、寬度、縱橫比等的立即計(jì)算允許對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行即時(shí)觀察和選通。

該算法還計(jì)算細(xì)胞的亮度和亮度偏差等參數(shù)，從而深入了解形態(tài)學(xué)特性。

系統(tǒng)保存每個(gè)檢測(cè)到的事件圖像，可以輕松查看異常值是碎片還是您正在尋找的稀有細(xì)胞。

3 如何表征力進(jìn)而計(jì)算楊氏模量？

骨髓生態(tài)位模擬物通過整合素信號(hào)調(diào)節(jié) HSPC 功能

造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞 (HSPC) 錨定在骨髓 (BM) 中稱為造血生態(tài)位的特殊微環(huán)境中。這些細(xì)胞由它們的自我更新能力和產(chǎn)生所有成熟血細(xì)胞的能力來(lái)定義。在臨床或組織工程使用之前，人類 HSPCs 可以通過表面抗原 CD34 進(jìn)行富集。由于這些細(xì)胞在大多數(shù)移植來(lái)源中占少數(shù)，并且適用細(xì)胞的數(shù)量有限，因此已使用細(xì)胞因子雞尾酒或小分子建立離體擴(kuò)增培養(yǎng)物. 然而， HSPCs 在懸浮液中的體外培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致異質(zhì)細(xì)胞群具有未定義的細(xì)胞身份。

在 BM 生態(tài)位中，HSPCs 不僅由細(xì)胞因子維持，而且由細(xì)胞-基質(zhì)粘附初步維持，通過粘附受體介導(dǎo)，例如整合素 (ITG)。在這方面，發(fā)現(xiàn) β1 (CD29) 和 β2 ITGs 促進(jìn) HSPCs 與間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞 (MSCs) 的初始接觸并且 β3 (CD61) 表達(dá)被證明是體內(nèi) 長(zhǎng)期再增殖 HSPCs 的標(biāo)志物. 因此，使用 HSPC 和 MSC 等生態(tài)位細(xì)胞的共培養(yǎng)離體重塑 BM 生態(tài)位逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，并被證明是干細(xì)胞擴(kuò)增的有前途的工具. 然而，在臨床或研究應(yīng)用中，兩個(gè)細(xì)胞群的直接接觸需要 HSPC 培養(yǎng)后純化。

為了解決這些問題，我們使用了一種在體外重塑BM細(xì)胞外基質(zhì)的新型培養(yǎng)方法，即從永生化間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（SCP-1）衍生的脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）支架。這種支架被發(fā)現(xiàn)具有高度可重復(fù)性，并提供超過 500 種蛋白質(zhì)，包括主要的生態(tài)位蛋白，如膠原蛋白、纖連蛋白、糖胺聚糖以及骨橋蛋白和信號(hào)分子，如基質(zhì)衍生因子 1 (SDF-1)。因此，提供了存在于BM壁龕中的粘合面和物理提示。發(fā)現(xiàn)周圍環(huán)境的生物力學(xué)力通過整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞，并在體外被證明可以控制 HSPC 的命運(yùn)。 _ _ _ _ 這些物理方面被證明是分化的標(biāo)志并驅(qū)動(dòng)細(xì)胞命運(yùn)決定。然而，HSPC 與 BM 基質(zhì)相互作用的詳細(xì)機(jī)制僅關(guān)于細(xì)胞外環(huán)境的了解較少。

通過培養(yǎng)從粒細(xì)胞集落刺激因子 (G-CSF) 動(dòng)員的健康供體的外周血 (PB) 中分離的人 CD34 +細(xì)胞，在去細(xì)胞 ECM 制劑上使用低濃度的細(xì)胞因子，我們可以分離兩種細(xì)胞部分：貼壁 (AT) 和上清液。 SN) 細(xì)胞，類似于與 MSC 的 HSPC 共培養(yǎng)物。使用實(shí)時(shí)變形細(xì)胞儀 (RT-DC)為了揭示塑料培養(yǎng)皿 (PCD) 中新鮮分離的 SN、AT 和經(jīng)典懸浮培養(yǎng)的 HSPCs 的生物力學(xué)表型，我們發(fā)現(xiàn)新鮮分離的細(xì)胞與培養(yǎng)細(xì)胞相比是同質(zhì)的可變形細(xì)胞和小細(xì)胞。與 PCD 培養(yǎng)或 SN 細(xì)胞相比，AT 細(xì)胞顯示肌動(dòng)蛋白聚合到應(yīng)力纖維、強(qiáng)烈的遷移行為和不易變形的表型。發(fā)現(xiàn) SDF-1 通過 CXC 趨化因子受體 4 型 (CXCR4) 被 AT 細(xì)胞主動(dòng)識(shí)別和內(nèi)化。此外，CXCR4 被認(rèn)為在 AT 細(xì)胞中偏向 ECM 蛋白。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)在 AT 細(xì)胞上誘導(dǎo) ITGαIIb、ITGαV 和 ITGβ3 的表面表達(dá)，并且可以證實(shí) ITGαvβ3 在 HSPC-ECM 相互作用中在粘附和遷移方面的重要作用。

實(shí)時(shí)熒光和可變形細(xì)胞儀

細(xì)胞機(jī)械表征的吞吐量近已接近傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的吞吐量。然而，這種非常敏感、無(wú)標(biāo)記的方法仍然缺乏分子標(biāo)記的特異性。在這里，我們開發(fā)了一種將實(shí)時(shí)一維成像熒光和可變形細(xì)胞術(shù)結(jié)合在一個(gè)儀器 (RT-FDC) 中的方法，從而開辟了許多新的研究途徑。我們通過使用亞細(xì)胞熒光定位來(lái)識(shí)別有絲分裂細(xì)胞并在 RNA 干擾屏幕中測(cè)試這些細(xì)胞的機(jī)械變化來(lái)證明其實(shí)用性。

具有分子特異性的基于智能圖像的變形輔助細(xì)胞分選

盡管無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分選對(duì)于提供原始細(xì)胞以供進(jìn)一步分析或使用是可取的，但目前的方法缺乏分子特異性和速度。在這里，我們將實(shí)時(shí)熒光和可變形細(xì)胞儀與基于駐表面聲波的分選相結(jié)合，并使用高效的深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)將分子特異性轉(zhuǎn)移到基于圖像的分選中。除了一般性能外，我們還通過從沒有標(biāo)簽的全血中分選中性粒細(xì)胞來(lái)展示這種方法的實(shí)用性。

虛擬流體通道中的高通量細(xì)胞和球體力學(xué)

利用固有材料特性（即彈性和粘度）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行表型分析，越來(lái)越被認(rèn)為在基礎(chǔ)和應(yīng)用生命科學(xué)研究中具有重要意義。早期的發(fā)展主要由諸如原子力顯微鏡、微量吸管以及光學(xué)拉伸等技術(shù)推動(dòng)，并專注于細(xì)胞骨架蛋白結(jié)構(gòu)和粘彈性細(xì)胞特性之間的基本相互作用，從而將物理學(xué)和生物學(xué)結(jié)合在一個(gè)分子以及細(xì)胞規(guī)模. 在這一領(lǐng)域，已發(fā)現(xiàn)機(jī)械敏感性是細(xì)胞如何響應(yīng)并與環(huán)境交流的基本機(jī)制。

機(jī)械表型研究細(xì)胞功能的巨大成功為轉(zhuǎn)化研究的應(yīng)用鋪平了道路，但需要提高樣品通量，這是現(xiàn)有方法無(wú)法達(dá)到的。在微流體裝置中找到了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)的一個(gè)答案。早在幾十年前，Hochmuth 等人。利用玻璃毛細(xì)管和高速視頻顯微鏡來(lái)研究流動(dòng)中的紅細(xì)胞變形. 在他們的開創(chuàng)性工作中，他們對(duì)紅細(xì)胞的形狀、方向和粘度進(jìn)行了廣泛的表征。玻璃毛細(xì)管具有所有微流體系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，即高通量和連續(xù)樣品處理能力，但缺乏設(shè)計(jì)和實(shí)施復(fù)雜流體流動(dòng)的靈活性。

軟光刻技術(shù)作為一種快速成型技術(shù)的引入*改變了創(chuàng)建微流體結(jié)構(gòu)的方式。使用彈性體的復(fù)制品使實(shí)驗(yàn)室芯片設(shè)備的臺(tái)式生產(chǎn)能夠訪問納米和微米級(jí)的單分子和單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。例如，Gossett 等人。展示了各種細(xì)胞系的高速機(jī)械表型分析，并展示了胚胎干細(xì)胞對(duì)其多能狀態(tài)的辨別能力，并具有足夠的統(tǒng)計(jì)能力. Dudani 等人擴(kuò)展了在拉伸流中拉伸細(xì)胞的想法。朝向夾流幾何形狀，其中液壓回路設(shè)計(jì)用于在多種拉伸模式下變形細(xì)胞。近，機(jī)械細(xì)胞表征也得到了實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)分析以及熒光標(biāo)記的補(bǔ)充，以將固有材料特性的敏感性與分子標(biāo)記的特異性結(jié)合起來(lái)。

雖然片上實(shí)驗(yàn)室設(shè)備現(xiàn)在通常用于轉(zhuǎn)化研究以評(píng)估粘彈性特性，例如，用于研究傳染病的發(fā)病29和監(jiān)測(cè)患者隨時(shí)間的狀態(tài)，但高通量分析這種無(wú)標(biāo)記的生物標(biāo)志物目前僅限于單細(xì)胞，不包括多細(xì)胞結(jié)構(gòu)。然而，詳細(xì)了解力學(xué)如何影響組織發(fā)育和體內(nèi)平衡將與建立將材料特性納入組織工程領(lǐng)域的 3D 細(xì)胞培養(yǎng)模型高度相關(guān). 盡管使用原子力顯微鏡和微量吸管抽吸目前的方法在球體上進(jìn)行了一些初步工作，但缺乏應(yīng)用單一實(shí)驗(yàn)方法同時(shí)對(duì)細(xì)胞和組織進(jìn)行高通量表征的潛力。

用于球體高速機(jī)械表型分析的合適微流體系統(tǒng)是玻璃比色皿。這些比色皿的直徑為數(shù)百微米，是基于熒光的流式細(xì)胞儀中的主要實(shí)體，其中通過激光激發(fā)和檢測(cè)發(fā)射光和散射光來(lái)分析易位細(xì)胞36. 雖然為球體提供足夠的限制，但商業(yè)流式細(xì)胞儀無(wú)法通過其機(jī)械特性分析單個(gè)細(xì)胞。原因之一在于比色杯的大橫截面積，這是減少碎屑阻塞所必需的，但也會(huì)導(dǎo)致流體動(dòng)力應(yīng)力幅值低。由于彈性和粘度的測(cè)定先需要將細(xì)胞暴露在足夠的剪切力和法向應(yīng)力下，其次需要檢測(cè)相應(yīng)的細(xì)胞變形，因此大比色皿直徑有效地抑制了機(jī)械測(cè)量。

在這里，我們引入了虛擬流體通道，以在商用流式細(xì)胞儀的玻璃比色皿內(nèi)創(chuàng)建可變橫截面的微流體收縮。虛擬通道是液體結(jié)合的微流體裝置，由低雷諾數(shù)下的共流水性聚合物溶液形成，其中穩(wěn)定的護(hù)套將樣品流限制在不混溶的液相之間。我們證明了虛擬流體通道尺寸可以在幾秒鐘內(nèi)實(shí)時(shí)調(diào)整，并能夠?qū)?xì)胞和球體的生物樣品進(jìn)行高通量流變測(cè)量。

利用定義通道直徑的簡(jiǎn)單比例定律，該定律取決于流速和粘度，但不取決于聚合物組成，我們研究了不同程度的虛擬限制中的懸浮細(xì)胞。與在泊肅葉流中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞相比，我們的結(jié)果揭示了類似于橢圓體的特征形狀。這種穩(wěn)態(tài)可以通過源自液-液界面粘度失配的流體動(dòng)力應(yīng)力來(lái)解釋，我們展示了它在簡(jiǎn)單的蠕變順應(yīng)性實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用，該實(shí)驗(yàn)允許提取材料特性。

我們開發(fā)了一個(gè)分析模型，并將界面應(yīng)力與層流系統(tǒng)泊肅葉流內(nèi)的典型剪切應(yīng)力和正應(yīng)力分布進(jìn)行比較。我們的結(jié)果證實(shí)，嵌入在大幾何形狀內(nèi)的虛擬通道中的小物體（例如比色皿中的單個(gè)細(xì)胞）的細(xì)胞變形受界面應(yīng)力控制，而大物體（例如，作為玻璃比色皿中的組織模型系統(tǒng)的球體）主要由剪切變形壓力。

我們將我們的技術(shù)與實(shí)時(shí)可變形細(xì)胞儀 (RT-DC) 相結(jié)合，用于生物樣品的高通量表征。在原理驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，我們表明虛擬通道可用于執(zhí)行機(jī)械細(xì)胞測(cè)定和無(wú)標(biāo)記識(shí)別細(xì)胞骨架改變。后，我們研究了單細(xì)胞力學(xué)對(duì)組織穩(wěn)定性的作用。虛擬通道允許直接比較單個(gè)細(xì)胞和相應(yīng)組織的流變特性。我們的結(jié)果表明，細(xì)胞的彈性模量比組織的彈性模量高出一個(gè)數(shù)量級(jí)，而組織的剛度隨著尺寸的增加而增加。

腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移中的機(jī)械適應(yīng)性

轉(zhuǎn)移之旅：應(yīng)對(duì)壓力和外力

迄今為止，轉(zhuǎn)移性進(jìn)展是癌癥致命的方面，繼發(fā)性腫瘤的發(fā)展占癌癥相關(guān)死亡總數(shù)的 90%（Steeg，2016 年）。導(dǎo)致這些致命二級(jí)病灶發(fā)展的過程遵循“轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)"并包括不同的連續(xù)步驟。它始于健康細(xì)胞獲得突變和表觀遺傳修飾，導(dǎo)致健康組織中原始原發(fā)性實(shí)體瘤的不受控制的增殖和腫瘤生長(zhǎng)（Grandér，1998 年；Vicente-Due?as 等人，2018 年）。這種初始增長(zhǎng)伴隨著有利微環(huán)境的發(fā)展（Werb 和 Lu，2015)，特別是通過新形成的血液/淋巴管在腫瘤周圍的血管生成/淋巴管生成 ( Stacker 等人，2014 年；Watnick，2012 年)，炎癥樣免疫反應(yīng) ( Whiteside，2006 年)，以及周圍細(xì)胞外的重塑矩陣（ECM）（Alexander 和 Cukierman，2016 年）。同時(shí)，來(lái)自原發(fā)性腫瘤的一些腫瘤細(xì)胞獲得了新的特性，使它們能夠離開原發(fā)性腫瘤并侵入周圍的基質(zhì)或沿著附近的血管移動(dòng)（Gritsenko et al., 2017）。對(duì)局部實(shí)質(zhì)的侵襲可以是主動(dòng)的（細(xì)胞自主）和/或由原發(fā)性腫瘤中發(fā)生的間質(zhì)液壓力驅(qū)動(dòng)（由腫瘤內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞以及滲漏血管和淋巴管之間的壓力差異引起）。Piotrowski-Daspit 等人，2016 年；Stuelten 等人，2018 年）。腫瘤內(nèi)淋巴管的發(fā)育有利于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 ( Karaman and Detmar, 2014) 雖然不是致命的，但通常伴隨著轉(zhuǎn)移過程。然而，威脅生命的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生在血流內(nèi)傳播時(shí)，通過直接進(jìn)入血管內(nèi)實(shí)現(xiàn)。有趣的是，近的研究表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可以作為血液定植的平臺(tái)（Brown 等人，2018 年；Pereira 等人，2018 年）。免疫細(xì)胞可以幫助血管內(nèi)滲入（Harney 等人，2015 年；Linde 等人，2018 年），并且可以作為單個(gè)細(xì)胞或侵襲性細(xì)胞的集體簇發(fā)生（Cheung 等人，2016 年））。當(dāng)腫瘤細(xì)胞在血流中轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，它們被稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (CTC)。如果 CTC 設(shè)法逃脫免疫系統(tǒng)并在血流力和粘附力之間的拉鋸戰(zhàn)中幸存下來(lái)（Fan 等人，2016 年），它們終將停止并粘附在血管壁上（Osmani 等人，2019 年）。或者，如果它們被困在小型毛細(xì)血管中，它們也可以獨(dú)立于粘附力而停止（Kienast 等人，2010 年）。在極少數(shù)情況下（特別是肺轉(zhuǎn)移），附著在內(nèi)皮上的腫瘤細(xì)胞會(huì)增殖并形成血管內(nèi)轉(zhuǎn)移（Al-Mehdi 等，2000）。然而，在大多數(shù)情況下，腫瘤細(xì)胞需要經(jīng)歷外滲，這是停滯的腫瘤細(xì)胞退出血液循環(huán)的過程。已經(jīng)描述了多種外滲機(jī)制，例如血細(xì)胞滲出 ( Strell and Entschladen, 2008 ) 和內(nèi)皮重塑 ( Lapis et al., 1988 )。循環(huán)的這種退出終允許腫瘤細(xì)胞到達(dá)附近器官的基質(zhì)/實(shí)質(zhì)，如果新到達(dá)的器官的微環(huán)境適合它們，它們可以在那里增殖并形成轉(zhuǎn)移（Peinado et al., 2017）或保持休眠狀態(tài)狀態(tài)直到他們的環(huán)境演變并允許他們茁壯成長(zhǎng)（Aguirre-Ghiso，2018 年；Nguyen 等人，2009 年）。

隨著腫瘤細(xì)胞通過所有這些步驟，它們面臨著各種變化的外部機(jī)械應(yīng)力，挑戰(zhàn)它們的生存和進(jìn)展，需要特定的機(jī)械性能。在腫瘤生長(zhǎng)的早期階段，由于流體進(jìn)入和排出間質(zhì)空間的不平衡（Mohammadi 和 Sahai，2018 年）以及微環(huán)境推回腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞會(huì)受到越來(lái)越高水平的壓縮應(yīng)力（圖 1 ）。擴(kuò)大腫瘤體積（Jain 等人，2014 年；Stylianopoulos 等人，2012 年）。壓縮應(yīng)力增加是由于腫瘤體積擴(kuò)大及其微環(huán)境在基質(zhì)重塑時(shí)變硬的組合，這發(fā)生在乳腺癌或胰腺癌等幾種腫瘤類型中。基質(zhì)重塑主要由基質(zhì)細(xì)胞（如腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞）協(xié)調(diào)，主要包括 ECM 的地形擾動(dòng)和硬化，并且已知有利于侵襲和轉(zhuǎn)移（Clark 和 Vignjevic，2015；Goetz 等，2011；Pickup 等。 , 2014 年），特別是通過膠原蛋白交聯(lián)、整合素聚集（Levental 等人，2009 年；Paszek 等人，2005 年），更重要的是通過誘導(dǎo)由徑向排列的纖維形成的路徑（Provenzano 等人，2006 年）。然后，這些軌跡可用于在主要成纖維細(xì)胞的幫助下進(jìn)行集體腫瘤細(xì)胞遷移（Gaggioli 等，2007）。盡管如此，基質(zhì)重塑導(dǎo)致的壓縮應(yīng)力增加的影響包括腫瘤細(xì)胞大小減少、增殖缺陷和細(xì)胞周期阻滯、體外研究時(shí)總體損害腫瘤生長(zhǎng)（Delarue 等人，2014 年；Taubenberger 等人，2019 年） . 由于腫瘤體積擴(kuò)大、壓縮應(yīng)力增加和 ECM 變硬，通常發(fā)現(xiàn)癌組織比健康組織更硬。在臨床水平上，惡性腫瘤確實(shí)被證明比良性腫瘤更堅(jiān)硬（Lorenzen 等人，2002 年；Venkatesh 等人，2008 年）。除了導(dǎo)致壓縮應(yīng)力外，封閉的原發(fā)性腫瘤環(huán)境也有利于癌細(xì)胞的集體侵襲而不是單細(xì)胞侵襲（Haeger et al., 2014）。這種影響可能會(huì)推動(dòng)侵入性、即將成為 CTC 簇的內(nèi)滲，與單個(gè) CTC 相比，其轉(zhuǎn)移潛力增加了 50 倍（Aceto 等人，2014 年）。有趣的是，已發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞簇在某些模型中表達(dá) keratin-14（Cheung 等人，2016 年），這可能與剛度增加有關(guān)（Seltmann 等人，2013 年）) 與經(jīng)歷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT) 的腫瘤細(xì)胞相比，例如顯示波形蛋白的高表達(dá)。腫瘤細(xì)胞聚集對(duì)腫瘤細(xì)胞的機(jī)械特性和機(jī)械適應(yīng)性的影響目前仍然是一個(gè)黑匣子，也將在本綜述中進(jìn)行簡(jiǎn)要推測(cè)。

圖 1。推測(cè)性研究腫瘤細(xì)胞剛度在整個(gè)轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)過程中的作用

侵襲、遷移、內(nèi)滲、循環(huán)、阻滯、粘附和外滲都以不同方式挑戰(zhàn)腫瘤細(xì)胞的機(jī)械特性，并有利于不同的機(jī)械表型。

癌細(xì)胞不僅在原發(fā)性腫瘤環(huán)境中暴露于機(jī)械應(yīng)力，而且在血管內(nèi)注入后也非常顯著，因?yàn)樗鼈冊(cè)谘髦幸苿?dòng)并通過轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)的血管內(nèi)步驟（Follain 等人，2020）。一旦它們?cè)谘髦校ɑ蛄馨凸軆?nèi)）循環(huán)，腫瘤細(xì)胞就會(huì)暴露于*不同的機(jī)械應(yīng)力（圖 1），這些機(jī)械應(yīng)力來(lái)自血流動(dòng)力學(xué)和血管收縮。如果 CTC 要成功完成轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)，就必須應(yīng)對(duì)這些壓力（Follain 等人，2020 年）。例如，高水平的流體剪切應(yīng)力 (> 1 Pa) 已被證明會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯 ( Chang et al., 2008) 甚至在腫瘤細(xì)胞循環(huán)時(shí)破壞它們 ( Regmi et al., 2017 )。后，只有少數(shù) CTC 可能能夠擺脫流體剪切應(yīng)力的影響，并有機(jī)會(huì)阻止并粘附到內(nèi)皮細(xì)胞上。值得注意的是，CTC 簇也被證明可以穿過毛細(xì)血管大小的血管，這可能會(huì)提供額外的保護(hù)（Au 等人，2016 年）。

兩種模型普遍適用于血液循環(huán)中的 CTC 阻滯：它們可以通過主動(dòng)粘附到血管壁上來(lái)阻滯（Follain 等人，2018 年；Osmani 等人，2019 年），或者如果血管地形紊亂和/或通過閉塞進(jìn)行阻滯。小直徑（Entenberg 等人，2018 年；Headley 等人，2016 年；Kienast 等人，2010 年；Paul 等人，2019 年；Wirtz 等人，2011 年）（圖 1）。后一種情況通常發(fā)生在微毛細(xì)血管中，CTC 被擠壓，因?yàn)樗鼈冃枰ㄟ^緊密的收縮平流以到達(dá)其靶器官附近的外滲部位。后，在血管周圍區(qū)域的 CTC 外滲后，開始成功的大轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)。在此步驟中，轉(zhuǎn)移細(xì)胞需要越過血管壁或血腦屏障（在腦轉(zhuǎn)移的情況下）等限制性障礙，以進(jìn)入休眠或擴(kuò)張，作為威脅生命的轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。

腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)的這些連續(xù)階段中遇到的所有機(jī)械應(yīng)力都明確地影響了它們的內(nèi)部機(jī)械狀態(tài)。通過微調(diào)它們的機(jī)械特性，腫瘤細(xì)胞可以適應(yīng)在每個(gè)步驟中威脅轉(zhuǎn)移進(jìn)展的各種機(jī)械應(yīng)力。特別是，他們自己的可調(diào)機(jī)械表型可能是應(yīng)對(duì)此處討論的壓力的關(guān)鍵。盡管這很可能發(fā)生，但據(jù)我們所知，只有有限的證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞在通過轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)的過程中接受特定的機(jī)械或其他線索后會(huì)改變其機(jī)械特性。我們想借此機(jī)會(huì)討論這些概念，并推測(cè)腫瘤細(xì)胞的機(jī)械特性如何沿著級(jí)聯(lián)進(jìn)化。舒爾茨，2018 年；孫等人，2014；Sunyer 等人，2009 年）。在這篇綜述中，我們簡(jiǎn)要討論了腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中的力學(xué)特征，補(bǔ)充、更新和擴(kuò)展了關(guān)于該主題的現(xiàn)有綜述（Kumar 和 Weaver，2009 年；Suresh，2007 年；Wirtz 等人，2011 年））。我們還討論了如何啟動(dòng)、控制和擾動(dòng)這些機(jī)械配置文件。我們進(jìn)一步推測(cè)它們的變形能力如何促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，并強(qiáng)調(diào)為什么這些方面將成為未來(lái)研究的重要途徑。我們終提出了這樣一種觀點(diǎn)，即明確定義的癌細(xì)胞靜態(tài)機(jī)械表型的圖片與成功導(dǎo)航轉(zhuǎn)移旅程所需的不同機(jī)械特性不相容。相反，動(dòng)態(tài)調(diào)整這些要求的能力可能是成功轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的機(jī)械特征。

測(cè)量細(xì)胞力學(xué)：方法、結(jié)果和局限性

迫切需要獨(dú)立于腫瘤力學(xué)考慮單細(xì)胞力學(xué)。到目前為止，主要通過觀察整個(gè)腫瘤或其相關(guān)基質(zhì)來(lái)研究腫瘤的機(jī)制。，大多數(shù)實(shí)體瘤的組織比健康組織更硬，這實(shí)際上在手動(dòng)觸診中得到了利用（Levental 等人，2009 年）。然而，一個(gè)腫瘤作為一個(gè)整體的剛度不能從構(gòu)成它的單個(gè)腫瘤細(xì)胞的剛度推導(dǎo)出來(lái)。先，它由許多可能影響腫瘤硬度的額外基質(zhì)成分（ECM、 Eble 和 Niland，2019 年；基質(zhì)細(xì)胞，Denton 等人，2018 年）組成。其次，許多獨(dú)立研究報(bào)告說(shuō)，腫瘤細(xì)胞實(shí)際上比健康細(xì)胞更柔軟（Alibert 等人，2017 年）即使在急性腫瘤切片中測(cè)量（Plodinec 等人，2012 年）。這一共識(shí)是通過使用各種不同的工具和方法達(dá)成的，這些工具和方法可用于在許多研究中研究單細(xì)胞力學(xué)。盡管這些方法不會(huì)成為本次審查的重點(diǎn)，因?yàn)槠渌麑彶橐呀?jīng)*涵蓋了它們（Darling 和 Di Carlo，2015；Urbanska 等人，2020；Van Vliet 等人，2003；Wu 等人，2018），我們簡(jiǎn)要討論先驅(qū)工具以及新的十分*的工具（見表 1) 以提供對(duì)該領(lǐng)域發(fā)展方式的一些見解。然后，在討論這些結(jié)果的局限性之前，我們將報(bào)告這些方法在腫瘤細(xì)胞硬度方面的發(fā)現(xiàn)。

表 1。用于測(cè)量癌細(xì)胞機(jī)械性能的精選技術(shù)概述

由于顯微鏡的發(fā)明，在細(xì)胞次可視化成為可能后不久，人們就提出了有關(guān)細(xì)胞力學(xué)以及探測(cè)它們或見證它們重要性的方法的問題（Pelling 和 Horton，2008 年）。從那以后，人們已經(jīng)采取了許多步驟來(lái)發(fā)明現(xiàn)在可用的許多現(xiàn)代設(shè)備。微量吸管 (MPA) 在 1950 年代次使用（Mitchison 和 Swann，1954) 并代表了個(gè)廣泛使用的工具，用于探測(cè)至今仍在使用的單細(xì)胞機(jī)械性能。其原理在于在微量移液器尖頭施加負(fù)壓，從而在玻璃毛細(xì)管內(nèi)吸出部分細(xì)胞并監(jiān)測(cè)隨著時(shí)間的推移吸出的細(xì)胞長(zhǎng)度。存在多種不同的連續(xù)模型來(lái)提取細(xì)胞的流變參數(shù)（González-Bermúdez 等人，2019 年；Hochmuth，2000 年）。MPA 可用于研究貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的力學(xué)。它終被原子力顯微鏡 (AFM) 取代，成為單細(xì)胞力學(xué)分析的黃金標(biāo)準(zhǔn) ( Dong et al., 2016 ; Radmacher et al., 1996 ; Thomas et al., 2013）。AFM 以相反的方式探測(cè)細(xì)胞的機(jī)械性能，方法是在細(xì)胞中進(jìn)行壓痕而不是吸氣。雖然通常僅限于測(cè)量粘附在表面上的細(xì)胞，但它的廣泛接受源于它堅(jiān)固而敏感的事實(shí)。一個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)是使用不同大小的探針，它允許記錄整個(gè)細(xì)胞表面的全細(xì)胞剛度和亞細(xì)胞剛度圖。這個(gè)范圍構(gòu)成了非常不同的機(jī)械測(cè)量，例如，從膜彎曲剛度和質(zhì)膜下的局部細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)到大量細(xì)胞骨架或細(xì)胞核測(cè)量。它也非常適合研究基板剛度對(duì)細(xì)胞力學(xué)的作用（盡管必須適當(dāng)考慮其分析的順應(yīng)基板的存在；Rheinlaender 等人，2020 年）。與測(cè)量粘附在表面上的細(xì)胞相比，利用光學(xué)力的工具，例如光學(xué)拉伸器 (OS)，可以捕獲懸浮細(xì)胞并使其變形（Guck 等人，2001 年）。這種技術(shù)與 MPA 或 AFM 不同的主要特點(diǎn)是測(cè)量*無(wú)接觸。這種方法也是個(gè)與微流體輸送 ( Lincoln et al., 2007 ) 和分揀 ( Faigle et al., 2015 ) 相結(jié)合的方法) 開始克服先前方法所呈現(xiàn)的低吞吐量缺陷。然而，只有隨著微流控方法的新發(fā)展，細(xì)胞力學(xué)分析才真正變得高通量——現(xiàn)在接近傳統(tǒng)基于熒光的流式細(xì)胞儀的速度。實(shí)時(shí)變形細(xì)胞儀 (RT-DC) 是近年來(lái)開發(fā)的此類微流控技術(shù)全系列的一種變體（Otto 等人，2015 年；Urbanska 等人，2020 年）。細(xì)胞以高速 (10 cm/s) 流過微流體通道，在其中它們?cè)跊]有任何接觸的情況下因剪切應(yīng)力和壓力梯度而變形。該技術(shù)允許以 >100 個(gè)細(xì)胞/秒的速率進(jìn)行機(jī)械表型分析，從而在生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域開辟了全新的應(yīng)用。Toepfner 等人，2018 年）?？傊瑴y(cè)量單細(xì)胞力學(xué)的方法有各種形狀和形式，允許在整個(gè)細(xì)胞的規(guī)?；蚣?xì)胞表面上感興趣的區(qū)域的范圍內(nèi)對(duì)懸浮或基板上的細(xì)胞進(jìn)行表征。彈性和粘度指標(biāo)都可以通過具有不同吞吐量水平的方法提取。所有這些的主要限制是它們未能提供有關(guān)原位腫瘤細(xì)胞機(jī)械狀態(tài)的信息（另見下一節(jié)）。

許多研究已經(jīng)使用這些測(cè)量工具來(lái)研究單個(gè)腫瘤細(xì)胞的機(jī)械特性與其轉(zhuǎn)移潛力之間的聯(lián)系（Suresh，2007）。早在 1990 年代，MPA 實(shí)驗(yàn)就發(fā)現(xiàn)致瘤大鼠成纖維細(xì)胞具有改變的粘彈性特性，使其與非致瘤對(duì)應(yīng)物相比具有增強(qiáng)的變形能力（Ward 等，1991）。AFM 研究一直報(bào)告相同的趨勢(shì)。Lekka 及其同事在 1990 年代后期次使用 AFM 比較兩種正常人膀胱上皮細(xì)胞系與三種癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞比正常細(xì)胞更順從（Lekka 等，1999）。對(duì)于乳腺上皮細(xì)胞系 ( Li et al., 2008 ; Liu et al., 2020 )、軟骨肉瘤細(xì)胞系 ( Darling et al., 2007 )、胃腸道腫瘤細(xì)胞 ( Suresh et al., 2005 )報(bào)告了基本相同的發(fā)現(xiàn)和卵巢上皮癌細(xì)胞（Xu et al., 2012）。當(dāng)用于探測(cè)人類乳房活檢的硬度曲線時(shí)，AFM 顯示癌細(xì)胞構(gòu)成了惡性組織中柔軟的部位（Plodinec 等人，2012 年）。此外，從肺癌、乳腺癌或胰腺癌患者身上采集的癌細(xì)胞和健康細(xì)胞的納米機(jī)械 AFM 分析顯示癌細(xì)胞軟 70%（Cross 等人，2007 年））。在后續(xù)調(diào)查中，這一數(shù)字增加到 80%（Cross 等人，2008 年）。同時(shí)，研究各種細(xì)胞形狀參數(shù)不出所料地證明了轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性人骨肉瘤細(xì)胞之間存在多個(gè)顯著的幾何差異，重要的是細(xì)胞體積、細(xì)胞面積、細(xì)胞圓度和細(xì)胞伸長(zhǎng)率（Lyons 等人，2016 年）。近一項(xiàng)比較同基因組腫瘤細(xì)胞變形能力的研究進(jìn)一步報(bào)告說(shuō)，成功轉(zhuǎn)移到肺部的細(xì)胞比循環(huán)腫瘤細(xì)胞和原發(fā)性腫瘤細(xì)胞要軟得多（Liu et al., 2020）。顯然，可變形性賦予轉(zhuǎn)移細(xì)胞選擇性優(yōu)勢(shì)，可用于預(yù)測(cè)。Swaminathan 等人，2011 年）。

雖然所有這些研究都是針對(duì)附著在基質(zhì)上的細(xì)胞進(jìn)行的，但分離和測(cè)量懸浮細(xì)胞也保持了正常細(xì)胞和癌細(xì)胞之間的機(jī)械差異。在懸浮分離后使用 OS 測(cè)量多個(gè)乳腺癌細(xì)胞系（MCF-7、MCF-10 和 MDA-MB-231）證實(shí)了細(xì)胞彈性和轉(zhuǎn)移潛能之間的密切相關(guān)性（Guck 等人，2005 年）。這一發(fā)現(xiàn)得到了對(duì) Ras 轉(zhuǎn)化上皮細(xì)胞 ( Gullekson et al., 2017 ) 的進(jìn)一步研究的支持，甚至在使用相同 OS 設(shè)備從癌癥患者口腔黏膜獲得的原發(fā)性鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中 ( Remmerbach et al., 2009)）。這對(duì)于新一代的微流體高通量技術(shù)來(lái)說(shuō)是個(gè)好兆頭，該技術(shù)還可以測(cè)量懸浮細(xì)胞。事實(shí)上，大多數(shù)使用高通量技術(shù)的出版物確實(shí)再次證實(shí)了癌細(xì)胞的變形能力增加（Ahmmed 等人，2018 年；Ciucci 等人，2017 年；Deng 等人，2017 年；Guillou 等人，2016 年； Holenstein 等人，2019 年；Wullkopf 等人，2018 年；Zhang 等人，2012 年）。作為一個(gè)具體的例子，發(fā)現(xiàn)使用 RT-DC 測(cè)量的不同骨肉瘤細(xì)胞的變形能力隨著轉(zhuǎn)移侵襲性的增加而變化（Holenstein 等人，2019）。變形性細(xì)胞術(shù)的另一種變體甚至已被用于證明可以根據(jù)其變形性在患者的胸腔積液中識(shí)別出惡性細(xì)胞（Tse 等人，2013 年），使機(jī)械表型分析接近臨床應(yīng)用（Guck 和 Chilvers，2013 年）。

雖然所有這些研究都表明單腫瘤細(xì)胞的變形能力和轉(zhuǎn)移潛能之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性，但很少有研究發(fā)現(xiàn)相反的情況。一個(gè)恰當(dāng)?shù)睦邮且豁?xiàng)研究報(bào)告說(shuō)，高度轉(zhuǎn)移的人類乳腺腫瘤細(xì)胞在通過 β-腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)硬化后變得更具侵襲性（Kim 等人，2016 年）。近，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲潛力也顯示出與細(xì)胞硬度成比例，這是通過福爾明 FMN1 賦予的（Monzo 等人，2020 年）。這種差異表明，絕大多數(shù)證明的細(xì)胞順應(yīng)性和轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性可能比看起來(lái)更復(fù)雜，這可能取決于所使用的方法（Holenstein 等人，2019 年；Wu 等人，2018 年）)，并且可能依賴于上下文。后一點(diǎn)對(duì)于血液腫瘤（白血?。┧坪跻呀?jīng)確立，這也顯示出癌細(xì)胞變硬的相反趨勢(shì)（Ekpenyong 等人，2012 年；Toepfner 等人，2018 年）。這種現(xiàn)象可能是由于造血系統(tǒng)中的成熟細(xì)胞需要變形才能循環(huán)，但癌細(xì)胞不是*分化的血細(xì)胞，因此仍然比健康血細(xì)胞更硬。

缺乏代表性的背景構(gòu)成了大多數(shù)上述研究的主要缺點(diǎn)。雖然對(duì)血癌的研究接近實(shí)現(xiàn)了使用微流體技術(shù)在接近其自然體內(nèi)環(huán)境的環(huán)境中進(jìn)行測(cè)量的目標(biāo)，但實(shí)體瘤的情況有所不同：測(cè)量主要是在培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞系上進(jìn)行的因此僅代表在 2D 底物上培養(yǎng)后達(dá)到的特定機(jī)械狀態(tài)，這與腫瘤細(xì)胞在其轉(zhuǎn)移過程中發(fā)現(xiàn)自己在體內(nèi)的環(huán)境幾乎沒有關(guān)系。直到允許在體內(nèi)進(jìn)行非破壞性的新工具細(xì)胞力學(xué)的探索已經(jīng)建立，轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞生物力學(xué)特性的發(fā)現(xiàn)不能與成功的轉(zhuǎn)移過程*相關(guān)。三維細(xì)胞培養(yǎng)代表了一種工具，可用于開始彌合這一差距并在更相關(guān)的條件下體外研究腫瘤細(xì)胞（ Lv 等人，2017 年）。后，盡管研究人員可以使用多種工具和方法來(lái)探索細(xì)胞力學(xué)，從而可以從各種不同的角度解決這個(gè)問題，但它也帶來(lái)了一個(gè)不幸的缺點(diǎn)，即幾乎不可能比較不同研究的結(jié)果，因?yàn)槊糠N方法都會(huì)出現(xiàn)具有非常具體的參數(shù)、規(guī)則和流變指標(biāo)集（Wu et al., 2018）。特別是，測(cè)量細(xì)胞的彈性和粘性模量在很大程度上取決于探測(cè)樣品的頻率或應(yīng)變率以及探針的性質(zhì)和尺寸（Urbanska 等人，2020 年），這進(jìn)一步使得出可靠的結(jié)論變得復(fù)雜跨越不同的研究。后，不能排除在腫瘤細(xì)胞中觀察到的機(jī)械變化只是一種附帶現(xiàn)象和其他導(dǎo)致轉(zhuǎn)移進(jìn)展的過程的副作用，而不是主要貢獻(xiàn)者的可能性，因?yàn)樯鲜鲅芯科駷橹怪皇窍嚓P(guān)的。證明因果關(guān)系是該領(lǐng)域接下來(lái)的重要步驟之一（Guck，2019）。

腫瘤細(xì)胞力學(xué)：被動(dòng)特性和主動(dòng)調(diào)節(jié)元件

到目前為止，我們已經(jīng)討論了可以通過施加外力和量化產(chǎn)生的變形來(lái)測(cè)量的細(xì)胞的被動(dòng)機(jī)械性能。然而，細(xì)胞對(duì)機(jī)械力的反應(yīng)也有一個(gè)主動(dòng)成分。腫瘤細(xì)胞的機(jī)械特性分為兩大類：主動(dòng)和被動(dòng)。任何導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞或其細(xì)胞器由于施加的外力而改變形狀的內(nèi)在特性都屬于被動(dòng)類別。另一方面，活性特性由機(jī)械傳感干預(yù)以響應(yīng)其環(huán)境線索來(lái)調(diào)整細(xì)胞的機(jī)械參數(shù)/行為的行為構(gòu)成。另一種說(shuō)法是內(nèi)在的機(jī)械性能會(huì)影響細(xì)胞在其環(huán)境中的行為方式，但與此同時(shí)，環(huán)境可以觸發(fā)細(xì)胞中影響其機(jī)械性能的主動(dòng)反應(yīng)。我們?cè)谏弦还?jié)討論的研究中明顯地缺失了機(jī)械性能和環(huán)境之間動(dòng)態(tài)關(guān)系的這一方面。因此，迫切需要準(zhǔn)確描述細(xì)胞力學(xué)在從原發(fā)性腫瘤到繼發(fā)性腫瘤的完整轉(zhuǎn)移過程中的作用。在本節(jié)中，我們將介紹與細(xì)胞力學(xué)有關(guān)的腫瘤細(xì)胞的結(jié)構(gòu)元素，這些結(jié)構(gòu)元素對(duì)細(xì)胞變形的能力至關(guān)重要。我們將他們的參與歸因于細(xì)胞力學(xué)的被動(dòng)或主動(dòng)方面。然而，機(jī)械傳感機(jī)制將不會(huì)詳細(xì)討論，因?yàn)樗鼈円言谄渌胤竭M(jìn)行了充分審查（環(huán)境可以觸發(fā)細(xì)胞中影響其機(jī)械性能的主動(dòng)反應(yīng)。我們?cè)谏弦还?jié)討論的研究中明顯地缺失了機(jī)械性能和環(huán)境之間動(dòng)態(tài)關(guān)系的這一方面。因此，迫切需要準(zhǔn)確描述細(xì)胞力學(xué)在從原發(fā)性腫瘤到繼發(fā)性腫瘤的完整轉(zhuǎn)移過程中的作用。在本節(jié)中，我們將介紹與細(xì)胞力學(xué)有關(guān)的腫瘤細(xì)胞的結(jié)構(gòu)元素，這些結(jié)構(gòu)元素對(duì)細(xì)胞變形的能力至關(guān)重要。我們將他們的參與歸因于細(xì)胞力學(xué)的被動(dòng)或主動(dòng)方面。然而，機(jī)械傳感機(jī)制將不會(huì)詳細(xì)討論，因?yàn)樗鼈円言谄渌胤竭M(jìn)行了充分審查（環(huán)境可以觸發(fā)細(xì)胞中影響其機(jī)械性能的主動(dòng)反應(yīng)。我們?cè)谏弦还?jié)討論的研究中明顯地缺失了機(jī)械性能和環(huán)境之間動(dòng)態(tài)關(guān)系的這一方面。因此，迫切需要準(zhǔn)確描述細(xì)胞力學(xué)在從原發(fā)性腫瘤到繼發(fā)性腫瘤的完整轉(zhuǎn)移過程中的作用。在本節(jié)中，我們將介紹與細(xì)胞力學(xué)有關(guān)的腫瘤細(xì)胞的結(jié)構(gòu)元素，這些結(jié)構(gòu)元素對(duì)細(xì)胞變形的能力至關(guān)重要。我們將他們的參與歸因于細(xì)胞力學(xué)的被動(dòng)或主動(dòng)方面。然而，機(jī)械傳感機(jī)制將不會(huì)詳細(xì)討論，因?yàn)樗鼈円言谄渌胤竭M(jìn)行了充分審查（Broders-Bondon 等人，2018 年；程等人，2017；Chin 等人，2016 年；霍夫曼和克羅克，2009 年；Janmey 和米勒，2011 年）。

細(xì)胞膜是細(xì)胞與其環(huán)境之間的界面，因此是受外力影響的個(gè)細(xì)胞成分（Le Roux 等人，2019 年）。細(xì)胞膜具有可以通過彎曲模量來(lái)描述的彈性特性，彎曲模量構(gòu)成了決定膜抵抗彎曲變形能力的被動(dòng)機(jī)械參數(shù)。彎曲模量是一種固有的細(xì)胞參數(shù)，在細(xì)胞類型之間會(huì)有所不同（Pontes 等人，2013 年）。此外，近的研究表明，細(xì)胞通過稱為小窩的小而有組織的質(zhì)膜內(nèi)陷積極響應(yīng)和緩沖機(jī)械約束（Nassoy 和 Lamaze，2012）。這些會(huì)影響表面張力，有助于膜的機(jī)械性能，并提供一些防止膜破裂的保護(hù)（Echarri 等人，2019 年；Sinha 等人，2011 年）。此外，已知膜會(huì)對(duì)各種機(jī)械應(yīng)力（例如拉伸、壓縮或剪切應(yīng)力）和各種響應(yīng)形式的地形線索作出積極反應(yīng)，包括膜的展平、折疊或流化（Le Roux 等人， 2019 年）?？傊?，細(xì)胞膜涉及細(xì)胞力學(xué)的被動(dòng)和主動(dòng)前沿，分別具有允許變形的彈性特性及其作為細(xì)胞與其環(huán)境之間的力感應(yīng)和響應(yīng)觸發(fā)界面的作用。

細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架相互作用，顯著的是位于下方的肌動(dòng)球蛋白皮層。早就知道這部分細(xì)胞骨架會(huì)影響膜變形（Farsad 和 De Camilli，2003 年）。重要的是，肌動(dòng)球蛋白皮層負(fù)責(zé)細(xì)胞的皮層張力。除了參與細(xì)胞僵硬、皮層張力水平或破損外，皮層張力還限制細(xì)胞變形（Chugh 和 Paluch，2018 年），并參與膜膨出（Paluch 等人，2005 年）和細(xì)胞尺度收縮（Koenderink 和Paluch，2018 年），使其成為細(xì)胞力學(xué)中的積極參與者，為小應(yīng)變下的細(xì)胞變形提供主要阻力。

肌動(dòng)球蛋白皮層只是細(xì)胞骨架的眾多組成部分之一，概括起來(lái)可以說(shuō)包括微絲、微管和中間絲。這些不同的組件是生物聚合物，它們都具有不同的機(jī)械性能，并且能夠動(dòng)態(tài)組裝和拆卸（Janmey，1991）。作為肌動(dòng)球蛋白皮層對(duì)小應(yīng)變變形的抵抗力的補(bǔ)充，中間絲負(fù)責(zé)抵抗大應(yīng)變下的細(xì)胞變形，并充當(dāng)安全帶，防止過度變形會(huì)破壞細(xì)胞（Charrier 和 Janmey，2016）。因此，細(xì)胞骨架作為其各部分的總和直接負(fù)責(zé)細(xì)胞的順應(yīng)性，因?yàn)樗刂浦鼈兊囊话阏硰椥蕴匦裕?/span>Wottawah 等人，2005 年）。它的動(dòng)態(tài)特性涉及細(xì)胞功能，例如細(xì)胞周期、遷移和粘附 ( Hall, 2009 )，其中細(xì)胞通過肌動(dòng)蛋白重組主動(dòng)變形。因此，細(xì)胞骨架不僅解釋了細(xì)胞的剛度及其承受被動(dòng)變形的能力，而且還解釋了它們?cè)诟鞣N過程中積極采用的一般細(xì)胞形狀（Bhadriraju 和 Hansen，2002）。此外，細(xì)胞骨架將細(xì)胞的細(xì)胞器定位在其細(xì)絲網(wǎng)絡(luò)內(nèi)，使其成為轉(zhuǎn)移過程中細(xì)胞形狀/變形與關(guān)鍵細(xì)胞器重新定位之間的直接聯(lián)系。在比細(xì)胞膜更大的程度上，細(xì)胞骨架參與了主動(dòng)和被動(dòng)的機(jī)械過程，可以被認(rèn)為是細(xì)胞力學(xué)的關(guān)鍵參與者（Fletcher 和 Mullins，2010 年）。

細(xì)胞核是與細(xì)胞骨架相連的眾多細(xì)胞器之一（Starr 和 Fridolfsson，2010 年），目前是癌癥研究領(lǐng)域的一個(gè)重要課題（Denais 和 Lammerding，2014 年），核膜不僅僅是一個(gè)簡(jiǎn)單的保護(hù)屏障。它涉及對(duì)癌癥進(jìn)展至關(guān)重要的各種功能，例如防止基因組改變、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞骨架組織和細(xì)胞遷移（de Las Heras 等人，2013 年）。尤其是腫瘤細(xì)胞的侵襲在很大程度上取決于細(xì)胞核的被動(dòng)機(jī)械特性和擠壓通過約束孔的能力（Harada 等人，2014 年），正如體外實(shí)驗(yàn)所證明的那樣微流控系統(tǒng) ( Fu et al., 2012 ) 和體內(nèi)( Denais et al., 2016 ) 細(xì)胞核在經(jīng)歷輪回的腫瘤細(xì)胞中劇烈變形。雖然細(xì)胞骨架能夠動(dòng)態(tài)重塑以允許細(xì)胞流過約束孔，但機(jī)械約束被傳遞到細(xì)胞器，例如細(xì)胞核，這是一個(gè)相對(duì)靜態(tài)和剛性的彈性物體。這為通過非常嚴(yán)格的限制進(jìn)行的重要遷移設(shè)定了硬性限制（Harada 等人，2014 年）。外力由原子核直接感知，其行為類似于機(jī)械傳感器（Shivashankar，2011 年；Kirby 和 Lammerding，2018 年) 并影響關(guān)鍵的細(xì)胞功能，例如染色質(zhì)組織和基因表達(dá)。細(xì)胞還使用它們的細(xì)胞核作為標(biāo)尺來(lái)測(cè)量它們的空間限制程度并相應(yīng)地調(diào)整它們的行為（Lomakin 等人，2020 年）。細(xì)胞在試圖通過緊密收縮時(shí)增加施加在細(xì)胞核上的力并有利于其變形的一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制是由 Arp2/3 蛋白驅(qū)動(dòng)的快速核周肌動(dòng)蛋白聚合（Thiam 等人，2016）。在這個(gè)過程中，聚集在細(xì)胞核周圍的肌動(dòng)蛋白絲對(duì)核包膜施加橫向力，進(jìn)而導(dǎo)致短暫的核層破裂，從而使核變形和腫瘤細(xì)胞通過。這種機(jī)制依賴于核纖層蛋白 A/C 的存在，它是一種中間絲和核膜的主要結(jié)構(gòu)蛋白。層粘連蛋白參與保護(hù)基因組，具有機(jī)械敏感性，并且可以影響重要的轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，例如 SRF 和 YAP/TAZ ( Irianto et al., 2016 )。lamin A/C 的水平對(duì)細(xì)胞核的粘彈性至關(guān)重要（Lammerding 等人，2006 年；Swift 和 Discher，2014 年) 并且，通過擴(kuò)展，調(diào)節(jié)其在受到力時(shí)被動(dòng)擠壓的能力，以允許細(xì)胞通過限制空間 ( Cao et al., 2016 )。還發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)與核纖層蛋白 A/C 一起有助于核變形（Hobson 等人，2020 年；Stephens 等人，2017 年）。近確定了構(gòu)成核膜的脂質(zhì)分布，并發(fā)現(xiàn)它們也在變形中起作用（Dazzoni et al., 2020）。雖然核變形僅與大應(yīng)變下的細(xì)胞變形有關(guān)，但它是遷移中的一個(gè)高度限制參數(shù)。核變形不僅通過允許腫瘤細(xì)胞進(jìn)行遷移來(lái)促進(jìn)轉(zhuǎn)移，而且還引發(fā)了 DNA 損傷。只要核包膜和 DNA 修復(fù)系統(tǒng)隨后啟動(dòng)以防止細(xì)胞死亡（Denais 等人，2016年）， DNA 損傷就會(huì)反過來(lái)通過驅(qū)動(dòng)基因組不穩(wěn)定性來(lái)增加腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲性（Lim 等人，2016年）。例如，由反復(fù)喪失核包膜完整性引起的 DNA 損傷現(xiàn)在被確定為腫瘤細(xì)胞侵襲性表型的重要驅(qū)動(dòng)因素（Nader 等人，2020 年）。

除細(xì)胞核外，近發(fā)現(xiàn)其他細(xì)胞器在轉(zhuǎn)移的情況下也具有改變的形狀和/或位置（表 2）。雖然這些改變與腫瘤細(xì)胞環(huán)境之間的關(guān)系以及它們?cè)谥鲃?dòng)/被動(dòng)機(jī)械事件中的作用目前仍不清楚，但它們可能會(huì)通過利用體內(nèi)相關(guān)研究的新進(jìn)展，在未來(lái)構(gòu)成一個(gè)重要的研究途徑。光學(xué)和電子顯微鏡 ( Karreman et al., 2016 ) 在轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)的整個(gè)步驟中跟蹤細(xì)胞器的形狀/定位（圖 2）。

表 2。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器概述及其在癌癥轉(zhuǎn)移中的作用

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圖 2?；铙w相關(guān)光和電子顯微鏡作為研究轉(zhuǎn)移過程中細(xì)胞變形和細(xì)胞器形狀/定位的工具

(A) 通過相關(guān)光學(xué)和電子顯微鏡 (CLEM) 獲得的 EM 圖像可以堆疊以在其環(huán)境中以 3 個(gè)維度重建腫瘤細(xì)胞體積。瀏覽生成的重建體積可以清楚地顯示關(guān)鍵細(xì)胞器的位置和形狀。細(xì)胞核呈綠色，線粒體呈黃色，溶酶體呈橙色，MVB 呈深紫色。

(B) 使用 CLEM，可以在納米級(jí)分辨率下在轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)的不同步驟（侵入、循環(huán)和停滯）解剖細(xì)胞。在特寫鏡頭中，細(xì)胞核和 RER 以淺綠色突出顯示，高爾基體以深綠色突出，線粒體以黃色突出，溶酶體以橙色突出，MVB 以紫色突出。