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膜蛋白研究利器（1）
膜蛋白研究利器：
Rho1D4親和純化體系+Nanodiscs(納米磷脂盤)
在人體蛋白中有大約
30%是膜蛋白，膜蛋白在細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)、信息、能量交換中發(fā)揮著重要作用，膜蛋白也成為大多數(shù)重要的藥物研究對(duì)象和靶點(diǎn)。ＦＤＡ批準(zhǔn)的新藥中就有大多數(shù)都以膜蛋白為靶點(diǎn)，幾乎所有的膜蛋白都是研究熱點(diǎn)。然而讓人吃驚的是，樂觀估計(jì)，目前已經(jīng)被透徹研究清楚結(jié)構(gòu)的膜蛋白僅占膜蛋白總量的1%。究其原因，是因?yàn)槟さ鞍滓栏交驒M跨在細(xì)胞膜的磷脂雙分子層上，使膜蛋白的表達(dá)、純化、結(jié)晶和結(jié)構(gòu)分析都有很大難度。市面上有一些專用于膜蛋白提取的試劑盒，大多數(shù)只能提取某幾種類型的膜蛋白，有些試劑盒用于提取膜總蛋白（包括質(zhì)膜和細(xì)胞器膜蛋白）。
現(xiàn)在，德國
Cube Biotech公司推出了一種新型膜蛋白提取工具能夠特異性親和純化重組膜蛋白，同時(shí)具有高純度、高特異性、高載量、溫和提取的特點(diǎn)，可以更好地幫助科研人員想深入研究膜蛋白，進(jìn)而攻克困擾人類的各種疾病。這種技術(shù)是基于1980年科學(xué)家在牛眼視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)的一種命名為Rho1D4的氨基酸序列以及其對(duì)應(yīng)的抗體來作為親和標(biāo)簽純化膜蛋白取得了非常好的效果，將Rho1D4抗體鏈接在瓊脂糖或磁珠上，用于親和層析帶有Rho1D4標(biāo)簽的膜蛋白。
Rho1D4特異性親和純化重組膜蛋白產(chǎn)品系列（瓊脂糖/磁珠）
當(dāng)膜蛋白被成功提取出后需要對(duì)其結(jié)構(gòu)及功能的研究。由于膜蛋白存在疏水部分，因此在體外容易聚合，所以需要找到一種合適的方法讓膜蛋白能夠穩(wěn)定地存在于細(xì)胞外的環(huán)境。傳統(tǒng)的膜蛋白提取后都保存在去污劑中，但自然條件下作為“鑲嵌"在細(xì)胞膜磷脂雙分子層中的蛋白一旦脫離了其穩(wěn)定的天然膜環(huán)境，便會(huì)對(duì)其生理功能的發(fā)揮產(chǎn)生不同程度的影響甚至受到*的破壞。Cube Biotech公司的Nanodiscs試劑盒可以解決分離出的膜蛋白在體外環(huán)境中穩(wěn)定存在的問題，確保膜蛋白能夠像在天然的細(xì)胞膜中維持其構(gòu)象和生物學(xué)功能，使其在有利的條件下用于后續(xù)的功能研究。
Cube Biotech Nanodiscs試劑盒系列產(chǎn)品
早在上個(gè)世紀(jì)
90年代，來自University of Illinois的生化學(xué)家Stephen Sligar教授就提出了命名為“Nanodisc"的磷脂層結(jié)構(gòu)。Nanodiscs這種膜蛋白提取工具打破了原有提取方法的瓶頸，能夠高效而溫和地輔助于膜蛋白的提取和保持其構(gòu)象，這種膜蛋白提取輔助工具可以解決傳統(tǒng)提取方法容易出現(xiàn)的問題。
目前，
Rho1D4純化體系和Nanodiscs在膜蛋白提取和研究方面已經(jīng)應(yīng)被許多著名的科研院校、制藥企業(yè)所采用和青睞。無論是兩種技術(shù)的配合使用或是單獨(dú)使用都很好地推動(dòng)了膜蛋白相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展。本文將對(duì)這兩種技術(shù)有更詳細(xì)的解讀與應(yīng)用說明。
Rho1D4體系和Nanodiscs的技術(shù)解讀與應(yīng)用說明
一、 Rho1D4體系：反應(yīng)條件溫和的高特異性親和純化方法
1) 什么是Rho1D4?
Rho1D4是指在牛眼視網(wǎng)膜細(xì)胞內(nèi)的牛視紫紅質(zhì)C端的最后九位氨基酸。Rho1D4得名于與該序列特異性結(jié)合的單克隆抗體1。與Rho1D4抗體結(jié)合的表位可以作為針對(duì)膜蛋白的超高特異性純化標(biāo)記。
通過基因修飾可在欲研究的目標(biāo)（膜）蛋白
C端加上Rho1D4標(biāo)記（如圖1）。一旦加載上該序列，即可用裝載有Rho1D4抗體的親和基質(zhì)去捕獲目標(biāo)蛋白，隨后添加Rho1D4肽，通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合基質(zhì)抗體的方式來洗脫目標(biāo)蛋白。采用這種方法，相比改變pH值等其他洗脫方式，更加地溫和。
圖1：假設(shè)有3個(gè)跨膜域的膜蛋白。Rho1D4標(biāo)簽加到膜蛋白C端，它的序列是T-E-T-S-Q-V-A-P-A
2) Rho1D4的歷史
Rho1D4的表位和抗體配對(duì)最早于20世紀(jì)80年代被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)科學(xué)家將Rho1D4抗體交聯(lián)包被在瓊脂糖凝膠上，用來純化通過猴腎細(xì)胞表達(dá)的牛視紫紅質(zhì)。1,2從那時(shí)起，Rho1D4系統(tǒng)開始被廣泛的用于小量膜蛋白提取的研究中，包括GPCR（G蛋白偶聯(lián)受體），ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporter），溶質(zhì)反向轉(zhuǎn)運(yùn)體和以及一種含四個(gè)跨膜域的膜蛋白。
3) Rho1D4系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)和用途
l 高特異性且高純度
Rho1D4系統(tǒng)包含：標(biāo)簽、抗體偶聯(lián)親和基質(zhì)（瓊脂糖或磁珠等）以及洗脫多肽。Rho1D4系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于抗體與抗原相互作用的高度特異性。表位序列和鏈長(zhǎng)對(duì)結(jié)合至關(guān)重要，例如：將第三位丙氨酸替換成甘氨酸，即移去一個(gè)甲基基團(tuán)，抗體將不再與表位結(jié)合。同樣，完整的九個(gè)氨基酸標(biāo)簽會(huì)與Rho1D4抗體結(jié)合緊密，去除兩個(gè)氨基酸則阻斷結(jié)合。因此，含有與Rho1D4表位相似序列的蛋白引起的非特異性結(jié)合被最小化，因此回收蛋白的純度非常高。（見表1） 3,4,5,6,7,8
l 高回收量
而Rho1D4系統(tǒng)的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是洗脫目標(biāo)蛋白的高回收率。包括細(xì)菌，酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系在內(nèi)的表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)針對(duì)特定的GPCR和其他膜蛋白進(jìn)行了優(yōu)化。用Rho1D4系統(tǒng)純化后的膜蛋白通過凝膠過濾以除去用于洗脫的多肽。使用此純化系統(tǒng)的科研人員均反饋蛋白回收量均達(dá)到毫克級(jí)。（見表1）3,4,5,6,7,8
l 純化的膜蛋白可用于功能性研究
純化的蛋白可用于功能性研究（配體結(jié)合的特性、蛋白與蛋白間的相互作用等）。
例1：
將標(biāo)記過的
ABCA4固定在載有Rho1D4抗體的基質(zhì)上來確定它與天然配體（一種視網(wǎng)膜的加成物）的親和結(jié)合特性，加入ATP后即釋放2。
例2：
CD81蛋白被整體固定在涂有Rho1D4抗體的平板上，它表現(xiàn)出和分離可溶蛋白片段與丙型肝炎病毒包膜E2蛋白相同的親和結(jié)合力3。
另外，有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體
AE1結(jié)構(gòu)域的重組蛋白被標(biāo)記且用Rho1D4系統(tǒng)純化后表現(xiàn)出與紅細(xì)胞來源的AE1蛋白有相同的硫酸外排速率。
4) 利用Rho1D4純化膜蛋白圖解簡(jiǎn)述
圖2：Rho1D4純化膜蛋白示意圖
表1：膜蛋白應(yīng)用實(shí)例
*純度是從低濃度經(jīng)一步Rho1D4 IAC在反應(yīng)溶液中得出的；產(chǎn)率是在洗脫成分濃縮并過SEC柱后計(jì)算的。
表1：有文獻(xiàn)報(bào)道的使用Rho1D4系統(tǒng)純化膜蛋白的純度和產(chǎn)率。盡管很多用Rho1D4系統(tǒng)純化的膜蛋白均為G蛋白偶聯(lián)受體家族，該系統(tǒng)也可以有助于辨別其他如轉(zhuǎn)運(yùn)體之類的膜蛋白。相關(guān)文章在參考文獻(xiàn)中。IAC：免疫親和層析；SEC：排阻層析。
二、Nanodiscs：還原細(xì)胞膜環(huán)境的人造磷脂雙分子層
1）什么是Nanodiscs
Nanodiscs是由膜支架蛋白(membrane scaffold proteins, MSPs)和磷脂分子構(gòu)成的磷脂雙分子層類膜結(jié)構(gòu)。通過這種特殊的結(jié)構(gòu)，膜蛋白可以整合到Nanodiscs中，保持膜蛋白生物學(xué)活性，為膜蛋白研究提供了充分的技術(shù)支持，科研人員便可以在有利的條件下繼續(xù)開展后續(xù)的功能研究。
膜支架蛋白(MSPs)是載脂蛋白(apo) A-I的縮減版，它們包繞著脂質(zhì)雙分子層從而形成圓盤狀的結(jié)構(gòu)，即納米盤3。其包含一個(gè)朝向內(nèi)部脂層的疏水面和朝外的親水面。這一結(jié)構(gòu)使得Nanodiscs在水溶液中具有很高的溶解度，同時(shí)在沒有去污劑的情況下也可以使膜蛋白溶解。
圖3：膜蛋白組裝到Nanodiscs的原理圖。綠色：膜支架蛋白（MSPs）；灰色：磷脂；橙色：膜蛋白
根據(jù)所使用的
MSPs的不同，形成的Nanodiscs的直徑會(huì)有所差異，這些納米級(jí)雙層微粒的直徑約為7-13納米。應(yīng)用廣泛的MSPs包括MSP1D1、MSP1D1-dH5和MSP1E3D1，具體尺寸見表2。
表2 ：不同類型的MSPs的尺寸
2）為什么選擇Nanodiscs
在膜蛋白研究方面，尤其是配體結(jié)合研究、構(gòu)象動(dòng)力學(xué)分析以及蛋白相互作用的研究，
Nanodiscs體系與其他體系相比有諸多優(yōu)勢(shì)4。Nanodiscs可以使膜蛋白，如GPCRs或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等，在人造環(huán)境里和納米盤重新組裝起來，形成類似天然的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。這種組裝到Nanodiscs中的可溶性蛋白可以在沒有去污劑的情況下用常規(guī)的層析方法來進(jìn)行純化。Nanodisc與膜蛋白的組裝結(jié)構(gòu)使得膜蛋白能夠在體外研究膜蛋白在生理上細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的兩面，因此也使得進(jìn)一步研究拮抗劑、激動(dòng)劑、G蛋白以及其它相互作用的配體不再受限。
3）Nanodiscs優(yōu)勢(shì)：
l Nanodiscs 能夠?yàn)樘崛〕鰜淼哪さ鞍滋峁┮粋€(gè)穩(wěn)定環(huán)境使它們繼續(xù)工作，就好像還沒有離開原來細(xì)胞膜一樣。 細(xì)胞膜蛋白之所以研究難度大是在于膜蛋白從細(xì)胞膜上提取出來以后就無法行使其正常功能，使得研究這些受體分子相當(dāng)困難。為了解決這個(gè)難題，Stephen Sligar 等科學(xué)家研發(fā)出一種脂質(zhì)納米圓盤 (lipid-based Nanodiscs)可以替代細(xì)胞膜上磷脂雙層膜 (phospholipid bilayer)，讓被純化出來的細(xì)胞膜蛋白如同一般細(xì)胞膜蛋白一樣穩(wěn)定地行使其正常功能。
l Nanodiscs 和天然細(xì)胞膜的組成結(jié)構(gòu)一樣，是由兩層磷脂層組成，每個(gè)磷脂分子都有活躍并親水的頭部基團(tuán)和疏水尾部。Nanodiscs 的結(jié)構(gòu)就像一般細(xì)胞膜一樣，由兩層背對(duì)背的磷脂 (phospholipid)所組成，為了使納米圓盤表面能保持這個(gè)扁平的形狀，研發(fā)人員為這個(gè)Nanodiscs 外面加上一圈蛋白質(zhì)(MSPs)。
l Nanodiscs 應(yīng)用前景非常廣泛，這個(gè)技術(shù)將有助于解開一大堆未知的膜蛋白的生化行為模式，也將幫助得到膜蛋白的結(jié)晶，從而應(yīng)用X 射線晶體衍射學(xué)獲得在原子水平上的結(jié)構(gòu)圖。
4）將膜蛋白組裝到Nanodiscs中的兩種方法：
方法1：組裝溶解在去污劑中的膜蛋白
在適合去污劑存在下，將膜蛋白溶解并純化，然后再添加
MSPs和磷脂。含有膜蛋白的Nanodiscs能夠自發(fā)地組裝，在去除掉表面活性劑后可以通過凝膠過濾（排阻層析）等方式來純化。
方法2：Nanodiscs與無細(xì)胞表達(dá)體系相結(jié)合
另一個(gè)方法是，膜蛋白在無細(xì)胞表達(dá)體系中被表達(dá)，通過加入已經(jīng)和膜蛋白結(jié)合預(yù)先組裝的Nanodiscs，膜蛋白能通過無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出來。采用這種方法，就無需再添加去污劑，在極大程度上降低了人為添加試劑對(duì)最終結(jié)果的影響。雖然通過無細(xì)胞表達(dá)體系會(huì)將蛋白的產(chǎn)量限制在微克級(jí)別，但這種方式卻為蛋白修飾、生物素酰化或同位素標(biāo)記等研究手段提供了更多發(fā)展方向的可能性。
圖4：膜蛋白與Nanodisc的兩種組裝機(jī)制
左圖：膜蛋白（橙色）溶解在去污劑（深灰色）中并與凍干的MSP（綠色）和磷脂（淺灰）混合。然后去除去污劑，形成蛋白-Nanodisc復(fù)合物。
右圖：預(yù)組裝了MSP與磷脂的Nanodiscs加入到無細(xì)胞反應(yīng)液（cell-free expression systems）中，新生的膜蛋白能夠自發(fā)地組裝到Nanodiscs中。
5）Nanodiscs的應(yīng)用
Nanodiscs為膜蛋白在體外提供了非常穩(wěn)定的環(huán)境，并可以在這個(gè)環(huán)境下研究配體的結(jié)合，或用NMR和SPR研究拮抗劑與激動(dòng)劑。MSPs可以與組氨酸標(biāo)簽結(jié)合來促進(jìn)純化、檢測(cè)和固定化。
Nanodiscs其它方面的應(yīng)用還包括共振拉曼（resonance Raman）、低溫電子顯微學(xué)（Cryo-EM）、MALDI 、蛋白活性研究和時(shí)間分辨熒光光譜。將抗原組裝到Nanodiscs中已經(jīng)被用來提高小鼠的免疫反應(yīng)，說明其具備用于制備疫苗和生產(chǎn)抗體的極大潛能。
最近，大腸桿菌全細(xì)胞膜蛋白組被組裝到了
Nanodiscs中，為以后的研究構(gòu)建了一個(gè)可溶解的膜蛋白信息庫。更多Nanodiscs的應(yīng)用請(qǐng)參見表3。
表3 :Nanodiscs應(yīng)用舉例
圖5：納米磷脂盤包裹膜蛋白研究實(shí)例（來源：Sligar Lab）
在過去幾年里，業(yè)內(nèi)已經(jīng)發(fā)表了多篇關(guān)于Nanodiscs的應(yīng)用文獻(xiàn)，例如：Nanodisc系列產(chǎn)品MSP1D1-His和MSP1D1dH5-His的應(yīng)用已刊登在《美國化學(xué)會(huì)-應(yīng)用材料與界面》（ACS Applied Materials & Interfaces），Cube Biotech科學(xué)家 Dr. Barbara Maertens、法蘭克福大學(xué)生物物理化學(xué)研究所 Dr. Frank Bernhard和Dr. Erik Henrich在Springer旗下的BIOspektrum期刊聯(lián)合發(fā)表文章并提出Cube Biotech的Nanodisc試劑盒是有效用于研究膜蛋白結(jié)構(gòu)/功能的新工具。目前，許多研究人員正在利用Nanodiscs研究出更多與之相關(guān)的技術(shù)與應(yīng)用。
圖6：有關(guān)Nanodiscs的文獻(xiàn)發(fā)表情況。從2003—2013年，利用Nanodiscs進(jìn)行膜蛋白研究的相關(guān)報(bào)道在不斷增加。（來源：PubMed）
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Cube Biotech 特異性親和純化膜蛋白產(chǎn)品系列
產(chǎn)品列表
For research use only.
Cube Biotech Nanodiscs產(chǎn)品系列
膜蛋白支架尺寸/匹配磷脂選擇
l Cube Biotech提供四種尺寸的Nanodiscs，由4種MSPs(MSP1D1/MSP1D1-dH5/MSP1E3D1/ MSP2N2)來實(shí)現(xiàn)
l Nanodiscs試劑盒(包含MSP、磷脂和膽酸鈉)和預(yù)組裝的Nanodiscs
產(chǎn)品列表
For research use only.
