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冷凍電鏡結(jié)合 Nanodisc 在膜蛋白研究的應(yīng)用
細(xì)胞生物膜所含的蛋白稱為膜蛋白，其參與和行使了眾多細(xì)胞功能，包括細(xì)胞與外界進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸、信息傳遞、能量交換等。膜蛋白擔(dān)任了各種神經(jīng)信號(hào)分子、激素和其他底物的受體，構(gòu)成了各種離子跨膜的通道，以及構(gòu)成各類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在人體蛋白中，有大約30%是膜蛋白。FDA批準(zhǔn)的新藥中，大多數(shù)都以膜蛋白為靶點(diǎn)。
隨著對(duì)膜蛋白工作機(jī)理的深入研究，新的細(xì)胞調(diào)控作用靶點(diǎn)不斷被發(fā)現(xiàn)，從而使作用于靶點(diǎn)的新藥能更有針對(duì)性地被開發(fā)出。例如現(xiàn)在市面上有不少基于細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白設(shè)計(jì)的藥物，常見一類抗高血壓藥（如氨氯地平），其主要功能是鈣離子通道阻滯劑，選擇性的同離子通道結(jié)合以阻滯鈣離子進(jìn)入細(xì)胞，從而導(dǎo)致心肌收縮力減弱、心率減慢和血管擴(kuò)張等以達(dá)到降壓的作用。膜蛋白結(jié)構(gòu)是設(shè)計(jì)并開發(fā)靶向作用于膜蛋白藥物的重要依據(jù)，但目前已被研究清楚結(jié)構(gòu)的膜蛋白僅占膜蛋白總量的1%。這是因?yàn)槟さ鞍滓栏交驒M跨在細(xì)胞膜的磷脂雙分子層上，所以膜蛋白的純化、結(jié)構(gòu)的解析等都十分有挑戰(zhàn)性。
對(duì)蛋白包括膜蛋白結(jié)構(gòu)的解析和研究是蛋白研究的基礎(chǔ)， X 射線晶體學(xué)、核磁共振（NMR）和冷凍電鏡（Cryo-EM）被稱作結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的三大利器，在現(xiàn)今已解析的膜蛋白結(jié)構(gòu)中，90% 以上都采用的是 X 射線晶體學(xué)方法，而核磁共振在小分子量的蛋白結(jié)構(gòu)解析中發(fā)揮了重要的作用。數(shù)十年里，X-射線晶體學(xué)一直是解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的優(yōu)先方法。然而 X 射線晶體學(xué)方法對(duì)樣品要求很高，需要得到具有衍射能力的蛋白晶體。但許多的蛋白質(zhì)，尤其是膜蛋白和蛋白質(zhì)復(fù)合物卻難以結(jié)晶。而另一方面，NMR 可用來解析較小的蛋白的結(jié)構(gòu)（一般不超過30 kDa），但較難用于分子量較大蛋白的結(jié)構(gòu)解析。在之前的很長(zhǎng)時(shí)間里，冷凍電鏡由于其解析結(jié)構(gòu)的分辨率較低，一直未能得到廣泛的應(yīng)用。近年來，冷凍電鏡領(lǐng)域里硬件和算法的突破性進(jìn)展使得現(xiàn)在能夠利用cryo-EM解析近原子分辨率的結(jié)構(gòu)，及大地促進(jìn)了結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展。
不同于晶體學(xué)，cryo-EM 所需的樣品量很少、無需生成晶體而只需保持水溶液環(huán)境下穩(wěn)定。在2013年末，美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校的Yifan Cheng教授與同事 David Julius 合作，利用單電子計(jì)數(shù)探測(cè)器，以近原子分辨率(3.4 ?)，確定了在疼痛和熱知覺中起中心作用的一種膜蛋白TRPV1的結(jié)構(gòu)。這一研究成果讓相關(guān)領(lǐng)域工作者開始重新審視冷凍電鏡在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的所能發(fā)揮的作用。這對(duì)于一些難結(jié)晶的蛋白質(zhì)，特別是膜蛋白的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究提供新的契機(jī)。隨著不斷的嘗試，利用冷凍電鏡對(duì)膜蛋白結(jié)構(gòu)解析的成果也越來越多，作為藥物研發(fā)方面的應(yīng)用，要分析小分子與蛋白質(zhì)的互作，而且分辨率越高越好?，F(xiàn)在 Subramaniam 等人達(dá)到了 cryo-EM 成像迄今為止的高分辨率（2.2 ?），此前只有 X 射線晶體衍射達(dá)到過這種水平的分辨率，這能為人們提供足夠的結(jié)構(gòu)信息，進(jìn)行更好的藥物研發(fā)。
圖 1：分辨率對(duì)觀測(cè)結(jié)果的影響（左）不同分辨率對(duì)應(yīng)能測(cè)定的分子結(jié)構(gòu)（右）
（圖片來源：Elad Binshtein, Melanie D. Biochemistry, 2015）
膜蛋白基本可分為三大類：整合膜蛋白、外周膜蛋白和脂錨定蛋白。整合膜蛋白占膜蛋白種類的 70%～80%。外周膜蛋白一般為水溶性，相對(duì)容易分離和純化，也較易獲得結(jié)晶供 X 射線衍射分析。難于研究的是整合膜蛋白，由于其具有疏水的跨膜區(qū)域，因此直接暴露在水溶液環(huán)境下非常不穩(wěn)定，因此需要添加去污劑進(jìn)行穩(wěn)定。而當(dāng)用去污劑保護(hù)膜蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析和功能研究時(shí)，又會(huì)因?yàn)槟さ鞍纂x開其天然磷脂雙分子而丟失有關(guān)脂質(zhì)互作及它們對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)影響這一層重要信息。這尤其對(duì)需要脂質(zhì)起結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)有較大影響。另外，不合適的去污劑會(huì)使膜蛋白不穩(wěn)定，且去污劑膠束與磷脂分子的結(jié)構(gòu)差異及水脂界面彎曲度在某些情況下可能造成膜蛋白結(jié)構(gòu)的改變。
為了更好地讓膜蛋白能夠穩(wěn)定在水溶液環(huán)境下通過冷凍電鏡進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，且避免去污劑會(huì)帶來的潛在影響，作為模擬細(xì)胞膜磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的Nanodisc 是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果不受各種不確定因素影響的解決方案。Nanodisc 由UIUC的Stephen Sligar 教授提出，其由膜支架蛋白(membrane scaffold proteins, MSPs)和磷脂分子構(gòu)成的磷脂雙分子層類膜結(jié)構(gòu)。Nanodisc 的理化性質(zhì)與細(xì)胞膜磷脂雙分子層相似，且膜蛋白可以整合到Nanodisc中，盡可能地保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和生物學(xué)活性，為膜蛋白的研究提供了有力的技術(shù)支持。膜支架蛋白（MSPs）是載脂蛋白（apo）A-I的縮減版，它們包繞著脂質(zhì)雙分子層從而形成圓盤狀的結(jié)構(gòu)，即Nanodisc。其包含一個(gè)朝向內(nèi)部脂層的疏水面和朝外的親水面。這一結(jié)構(gòu)使得Nanodisc 在水溶液中具有很高的溶解度，同時(shí)具有非常高的穩(wěn)定性。通過Nanodisc 包裹，純化后的膜蛋白在保持空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和活性的同時(shí)，也將模擬膜蛋白原有在細(xì)胞膜上的狀態(tài)，跨膜域被包埋在磷脂雙分子層內(nèi)部。
圖 2：膜蛋白組裝到 Nanodiscs 的原理圖。
綠色：膜支架蛋白（MSPs）；灰色：磷脂；橙色：膜蛋白
（圖片來源 Cube Biotech 網(wǎng)站）
將膜蛋白組裝到 Nanodiscs 中主要有兩種方法：
· 第一：組裝溶解在去污劑中的膜蛋白在去污劑存在條件下將膜蛋白純化，然后再添加 MSPs 和磷脂。含有膜蛋白的 Nanodiscs 能夠自發(fā)地組裝，在去除掉表面活性劑后可以通過凝膠過濾（排阻層析）等方式來純化。
· 第二：Nanodiscs 與無細(xì)胞表達(dá)體系相結(jié)合，針對(duì)于一些特殊蛋白，例如帶有毒性的蛋白可通過無細(xì)胞表達(dá)體系表達(dá)，通過加入已經(jīng)預(yù)先組裝的 Nanodiscs 使表達(dá)出的膜蛋白通過自組裝鑲嵌進(jìn)去。
圖 3：膜蛋白與 Nanodisc 的兩種組裝機(jī)制
（圖片來源 Cube Biotech 網(wǎng)站）
左圖：膜蛋白（橙色）溶解在去污劑（深灰色）中并與凍干的 MSP（綠色）和磷脂（淺灰）混合。然后去除去污劑，形成蛋白-Nanodisc 復(fù)合物。
右圖：預(yù)組裝了 MSP 與磷脂的 Nanodisc 加入到無細(xì)胞反應(yīng)液（cell-free expression systems）中，新生的膜蛋白能夠自發(fā)地組裝到 Nanodisc 中。
結(jié)合 Nanodisc 和冷凍電鏡這兩項(xiàng)技術(shù)，越來越多的膜蛋白結(jié)構(gòu)得以解析。其中較有代表性的包括Yifan Cheng教授通過闡明 Nanodisc 中 TRPA1 的結(jié)構(gòu)表明了配體和脂質(zhì)的作用機(jī)制，確定了環(huán)狀脂質(zhì)和調(diào)節(jié)脂質(zhì)的定位，證實(shí)通過形成一種三元復(fù)合物，特異的磷脂互作促進(jìn)了一種蜘蛛毒素等相關(guān)配體結(jié)合 TRPV1，相關(guān)成果發(fā)表在 2016 年 Nature 上。 此外由于 Nanodisc 還可以實(shí)現(xiàn)在同一個(gè) Nanodisc 上實(shí)現(xiàn)寡聚、二聚和單體的鑲嵌，來自歐洲的 Rouslan G 及其合作者在 Nanodisc 上鑲嵌 ryanodine 受體四聚體使用冷凍電鏡實(shí)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)解析，相關(guān)成果也發(fā)表在 2015 年 Nature 雜志上。相信伴隨著冷凍電鏡解析能力的不斷提升，以及如 Nanodisc 穩(wěn)定膜蛋白和還原膜蛋白天然環(huán)境技術(shù)的不斷出現(xiàn)，膜蛋白結(jié)構(gòu)解析和功能研究將會(huì)迎來全新的發(fā)展。
圖 4：通過冷凍電鏡解析 Nanodisc 包裹 TRPA1 蛋白結(jié)構(gòu)，b、c 灰色部分為 Nanodisc
（圖片來源于Yifan Cheng2016 Nature 文章）
圖 5：通過冷凍電鏡解析 Nanodis 包裹 ryanodine 受體四聚體結(jié)構(gòu)，灰色部分為 Nanodisc
（圖片來源于 Rouslan G 2015 Nature 文章）
參考：
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