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庫柏聯(lián)合發(fā)表Nanodisc對膜蛋白研究有重大作用和意義的文章
Cube Biotech科學(xué)家 Dr. Barbara Maertens、法蘭克福大學(xué)生物物理化學(xué)研究所 Dr. Frank Bernhard和Dr. Erik Henrich在Springer旗下的BIOspektrum期刊聯(lián)合發(fā)表文章并提出Cube Biotech 研制的Nanodisc納米磷脂盤是前沿的用于高效提取膜蛋白以及研究膜蛋白結(jié)構(gòu)/功能的新工具。
應(yīng)用與產(chǎn)品
無細(xì)胞生物合成
通過優(yōu)化納米盤脂質(zhì)環(huán)境產(chǎn)生的功能性膜蛋白
目前對于新型藥物而言，膜蛋白是特別重要的蛋白類型。G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs），離子鍵通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白促成細(xì)胞對細(xì)胞的聯(lián)系、接收外部信號、營養(yǎng)素以及有效物質(zhì)的運(yùn)輸。膜上的酶參與例如阿爾茨海默的產(chǎn)生，線粒體里能量的產(chǎn)生以及細(xì)胞壁合成。膜蛋白的正常折疊、穩(wěn)定和功能通常依賴于一種特殊的脂質(zhì)環(huán)境。這種特質(zhì)使得獲取足夠數(shù)量和質(zhì)量的膜蛋白發(fā)展新的有效應(yīng)用變得特別困難。
無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成
無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成作為開放的系統(tǒng)，是合成生物學(xué)領(lǐng)域的一種重要技術(shù)。從埃希氏菌屬的大腸桿菌群可以獲取高質(zhì)量的溶解產(chǎn)物，其帶有有效的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)系統(tǒng)。這種細(xì)菌溶解產(chǎn)物的效率明顯優(yōu)于真核溶解產(chǎn)物，并且能產(chǎn)生用于結(jié)晶[1,2]或核磁共振光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究所必需的大量復(fù)合膜蛋白[3,4]。
產(chǎn)物的增加通過合成底物和能量儲備以及一系列特殊添加物而增加。這樣就可以根據(jù)膜蛋白的需求優(yōu)化反應(yīng)條件[5]。我們使用的二室法（連續(xù)交換無細(xì)胞或CECF）可以在20小時內(nèi)生成每毫升數(shù)毫克的反應(yīng)物。膜蛋白的無細(xì)胞生產(chǎn)十分成功，因?yàn)榭梢韵齻鹘y(tǒng)的細(xì)胞生產(chǎn)過程中由于高毒性、強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)分解或低效的細(xì)胞膜蛋白提取等原因引起的常見問題。另外，隨后的膜蛋白純化步驟通過親和層析法而減少。甚至要求很高的如GPCRs等膜蛋白也可以在數(shù)天內(nèi)產(chǎn)出所需求的數(shù)量[6]。
膜蛋白的表達(dá)穩(wěn)定化
無細(xì)胞合成的另一特點(diǎn)是膜蛋白的共轉(zhuǎn)移溶解可能性。除了去污劑或者其他兩相分子物質(zhì)，這里還可以使用納米磷脂盤。納米磷脂盤是直徑為8到15納米的雙層磷脂，通過膜支架蛋白（MSP）的不同衍生物和不同脂質(zhì)聚合起來[7]。因?yàn)楹芏嗄さ鞍讜捎谌ノ蹌┑淖冃宰饔枚テ涔δ埽韵鄬Χ?，這種納米磷脂盤的共轉(zhuǎn)移溶解是很有價(jià)值的另一種選擇。MSP常常帶有組氨酸標(biāo)簽，所以我們在無細(xì)胞反應(yīng)混合物的膜蛋白納米磷脂盤復(fù)合物的純化和固定方面使用了2號鏈球菌或Rho1D4親和標(biāo)記。
用于膜蛋白質(zhì)量優(yōu)化的脂質(zhì)分析方法
磷脂結(jié)構(gòu)影響納米磷脂盤膜的厚度、流動性和表面負(fù)荷，并且因此大大影響了膜蛋白的插入、折疊和穩(wěn)定性。另外，特殊磷脂通常是膜蛋白的必要構(gòu)件[8]。因此，必須對每個目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行不同脂質(zhì)、不同脂質(zhì)混合物和不同納米磷脂盤大小的全面分析[9]。我們開發(fā)的分析平臺能夠在不同微量滴定形式下進(jìn)行反應(yīng)條件和添加物的平行分析[圖1]。記錄過程分為三個階段：(1)通過調(diào)整反應(yīng)條件優(yōu)化蛋白質(zhì)表達(dá)率，(2)針對來自MSP和脂質(zhì)以及脂質(zhì)混合物的不同組合的納米磷脂盤進(jìn)行共轉(zhuǎn)移溶解評估，納米磷脂盤濃縮物調(diào)整表達(dá)率和目標(biāo)基因的插入效率，(3)對獲取的蛋白/納米磷脂盤復(fù)合物通過適當(dāng)?shù)姆椒ǎ?，通過對酶活性的確定或者配體的結(jié)合進(jìn)行分析。
對去污劑敏感的膜蛋白的生成
人類內(nèi)皮細(xì)胞受體ETA和ETB是血壓及其他生理過程的基本調(diào)節(jié)器。由去污劑膠粒包裹的G蛋白偶聯(lián)受體的不穩(wěn)定性阻礙了其體外分析。只能通過在預(yù)制的納米磷脂盤里的共轉(zhuǎn)移插入，通過優(yōu)化的脂質(zhì)組分穩(wěn)固兩個G蛋白偶聯(lián)受體，并且通過表面等離子共振光譜（SPR）檢查兩個G蛋白偶聯(lián)受體。（圖2A）。以確定的ETA和ETB不同配位可選性和高階仿射配體結(jié)合與不同組織發(fā)出的數(shù)據(jù)一致。
