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Rho1D4純化體系：為重組膜蛋白提取設(shè)計(jì)
膜蛋白的重要性不言而喻，假如細(xì)胞膜是守護(hù)細(xì)胞的城墻，而膜蛋白就是站在城墻上的各司其職的士兵，肩負(fù)著把守城門(mén)、傳遞信號(hào)、運(yùn)輸物質(zhì)等重要職責(zé)。膜蛋白一旦“失守"，就會(huì)造成細(xì)胞功能紊亂，進(jìn)而引起組織和器官發(fā)生病變，使身體遭受病痛侵?jǐn)_。這也就是為什么膜蛋白成為大多數(shù)重要的藥物研究對(duì)象和靶點(diǎn)。
在人體蛋白中，有大約30%是膜蛋白，FDA批準(zhǔn)的新藥中，大多數(shù)都以膜蛋白為靶點(diǎn)，幾乎所有的膜蛋白都是研究熱點(diǎn)。然而讓人吃驚的是，樂(lè)觀估計(jì)，目前已經(jīng)被透徹研究清楚結(jié)構(gòu)的膜蛋白僅占膜蛋白總量的1%。
究其原因，是因?yàn)槟さ鞍滓栏交驒M跨在細(xì)胞膜的磷脂雙分子層上，使膜蛋白的表達(dá)、純化、結(jié)晶和結(jié)構(gòu)分析都有很大難度。由于非常難以獲得高純度的膜蛋白，進(jìn)而解析它們的結(jié)構(gòu)和功能，使根據(jù)膜蛋白結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)藥物的方法難以施展，而這種方法是目前開(kāi)發(fā)藥物有效的方法之一，因?yàn)樗幬镆苡行е委煵⑶沂垢弊饔?/span>盡量減小，作用位點(diǎn)就必須精準(zhǔn)。
很多科研人員想深入研究膜蛋白，希望攻克困擾人類(lèi)的各種疾病，但由于提取高純度目標(biāo)膜蛋白并不便捷，從而影響研發(fā)進(jìn)度。市面上有一些專(zhuān)用于膜蛋白提取的試劑盒，大多數(shù)只能提取某幾種類(lèi)型的膜蛋白，有些試劑盒用于提取膜總蛋白（包括質(zhì)膜和細(xì)胞器膜蛋白）。
目前，有一種新型膜蛋白提取工具能夠特異性親和純化重組膜蛋白，并具有高純度、高特異性、高載量、溫和提取的優(yōu)點(diǎn)，是基于1980年科學(xué)家在牛眼視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)的一種命名為Rho1D4的氨基酸序列以及其對(duì)應(yīng)的抗體來(lái)作為親和標(biāo)簽純化膜蛋白取得了非常好的效果，將Rho1D4抗體鏈接在瓊脂糖或磁珠上，用于親和層析帶有Rho1D4標(biāo)簽的膜蛋白，能解決這些研究難題。
1）什么是Rho1D4?
Rho1D4是指在牛眼視網(wǎng)膜細(xì)胞內(nèi)的牛視紫紅質(zhì)C端的后九位氨基酸。Rho1D4得名于與該序列特異性結(jié)合的單克隆抗體。與Rho1D4抗體結(jié)合的表位可以作為針對(duì)膜蛋白的高特異性純化標(biāo)記。
通過(guò)基因修飾可在欲研究的目標(biāo)（膜）蛋白C端加上Rho1D4標(biāo)記（如圖1）。一旦加載上該序列，即可用裝載有Rho1D4抗體的親和基質(zhì)去捕獲目標(biāo)蛋白，隨后添加Rho1D4肽，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合基質(zhì)抗體的方式來(lái)洗脫目標(biāo)蛋白。采用這種方法，相比改變pH值等其他洗脫方式，更加地溫和。
圖1：假設(shè)有3個(gè)跨膜域的膜蛋白。Rho1D4標(biāo)簽加到膜蛋白C端，它的序列是T-E-T-S-Q-V-A-P-A
2）Rho1D4的歷史
Rho1D4的表位和抗體配對(duì)于20世紀(jì)80年代被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)科學(xué)家將Rho1D4抗體交聯(lián)包被在瓊脂糖凝膠上，用來(lái)純化通過(guò)猴腎細(xì)胞表達(dá)的牛視紫紅質(zhì)。從那時(shí)起，Rho1D4系統(tǒng)開(kāi)始被廣泛的用于小量膜蛋白提取的研究中，包括GPCR（G蛋白偶聯(lián)受體），ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporter），溶質(zhì)反向轉(zhuǎn)運(yùn)體和以及一種含四個(gè)跨膜域的膜蛋白。
3）Rho1D4系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)和用途
高純度
Rho1D4系統(tǒng)包含：標(biāo)簽、抗體偶聯(lián)親和基質(zhì)（瓊脂糖或磁珠等）以及洗脫多肽。Rho1D4系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于抗體與抗原相互作用的高度特異性。表位序列和鏈長(zhǎng)對(duì)結(jié)合至關(guān)重要。例如，將第三位丙氨酸替換成甘氨酸，即移去一個(gè)甲基基團(tuán)，抗體將不再與表位結(jié)合。同樣，完整的九個(gè)氨基酸標(biāo)簽會(huì)與Rho1D4抗體結(jié)合緊密，去除兩個(gè)氨基酸則阻斷結(jié)合。因此，含有與Rho1D4表位相似序列的蛋白引起的非特異性結(jié)合被盡量減少，因此回收蛋白的純度非常高。（見(jiàn)表1）
高回收量
而Rho1D4系統(tǒng)的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是洗脫目標(biāo)蛋白的高回收率。包括細(xì)菌，酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系在內(nèi)的表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)針對(duì)特定的GPCR和其他膜蛋白進(jìn)行了優(yōu)化。用Rho1D4系統(tǒng)純化后的膜蛋白通過(guò)凝膠過(guò)濾以除去用于洗脫的多肽。使用此純化系統(tǒng)的科研人員均反饋蛋白回收量均達(dá)到毫克級(jí)。（見(jiàn)表1）
純化的膜蛋白可用于功能性研究
純化的蛋白可用于功能性研究，如配體結(jié)合的特性，蛋白與蛋白間的相互作用。例如，將標(biāo)記過(guò)的ABCA4固定在載有Rho1D4抗體的基質(zhì)上來(lái)確定它與天然配體（一種視網(wǎng)膜的加成物）的親和結(jié)合特性，加入ATP后即釋放。又例如，CD81蛋白被整體固定在涂有Rho1D4抗體的平板上，它表現(xiàn)出和分離可溶蛋白片段與丙型肝炎病毒包膜E2蛋白相同的親和結(jié)合力。另外，有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體AE1結(jié)構(gòu)域的重組蛋白被標(biāo)記且用Rho1D4系統(tǒng)純化后表現(xiàn)出與紅細(xì)胞來(lái)源的AE1蛋白有相同的硫酸外排速率。
4）利用Rho1D4純化膜蛋白圖解簡(jiǎn)述
步驟1：
結(jié)合
將Rho1D4標(biāo)記的蛋白與載有Rho1D4抗體的瓊脂糖一同孵育使得目標(biāo)蛋白被固定在吸附材料上。
步驟2：
清洗
將雜蛋白和其他裂解液成分洗去，留下與親和基質(zhì)結(jié)合的目標(biāo)蛋白。
步驟3：
洗脫
過(guò)量Rho1D4肽與基質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，釋放出目標(biāo)蛋白在洗脫液中收集。
表1：膜蛋白應(yīng)用實(shí)例
*純度是從低濃度經(jīng)一步Rho1D4 IAC在反應(yīng)溶液中得出的；產(chǎn)率是在洗脫成分濃縮并過(guò)SEC柱后計(jì)算的。
表1：有文獻(xiàn)報(bào)道的使用Rho1D4系統(tǒng)純化膜蛋白的純度和產(chǎn)率。盡管很多用Rho1D4系統(tǒng)純化的膜蛋白均為G蛋白偶聯(lián)受體家族，該系統(tǒng)也可以有助于辨別其他如轉(zhuǎn)運(yùn)體之類(lèi)的膜蛋白。相關(guān)文章在參考文獻(xiàn)中。IAC：免疫親和層析；SEC：排阻層析。
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