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膜蛋白研究利器 Nanodiscs(納米磷脂盤(pán))
膜蛋白在細(xì)胞與外界進(jìn)行物質(zhì)、信息、能量交換中具有重要的作用和意義，因此膜蛋白成為了當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。但是由于膜蛋白存在疏水部分，因此在體外容易聚合，所以需要找到一種合適的方法讓膜蛋白能夠穩(wěn)定地存在于細(xì)胞外的環(huán)境。傳統(tǒng)的膜蛋白提取方法是利用去污劑來(lái)提取，但是經(jīng)過(guò)去污劑提取后的膜蛋白其構(gòu)象和生物學(xué)活性都較易因?yàn)楦鞣N問(wèn)題被破壞，作為“鑲嵌"在細(xì)胞膜磷脂雙分子層中的蛋白，一旦脫離了其穩(wěn)定的天然膜環(huán)境，便會(huì)影響甚至失去其生理功能，即使膜蛋白被成功地提取出來(lái)，也達(dá)不到很好的研究結(jié)果。
早在上個(gè)世紀(jì)90年代，來(lái)自University of Illinois的生化學(xué)家Stephen Sligar教授就提出了一種命名為“Nanodisc"的磷脂層結(jié)構(gòu)，能夠有效地解決膜蛋白提取后在體外環(huán)境中穩(wěn)定存在的問(wèn)題，從而確保膜蛋白能夠像在天然的細(xì)胞膜中維持其構(gòu)象和生物學(xué)功能。Nanodiscs這種全新的膜蛋白提取工具突破了原有提取方法的瓶頸，能夠高效而溫和地輔助于膜蛋白的提取和保持其構(gòu)象，這種全新的膜蛋白提取輔助工具可以解決以上傳統(tǒng)提取方法容易出現(xiàn)的問(wèn)題。
Nanodiscs已經(jīng)應(yīng)用于許多著名的科研院校、制藥企業(yè)，推動(dòng)了膜蛋白相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展。本文將對(duì)這種技術(shù)做一個(gè)詳細(xì)的解讀與應(yīng)用說(shuō)明。
1）什么是Nanodiscs?
Nanodiscs是由膜支架蛋白(membrane scaffold proteins, MSPs)和磷脂分子構(gòu)成的磷脂雙分子層類(lèi)膜結(jié)構(gòu)。通過(guò)這種特殊的結(jié)構(gòu)，膜蛋白可以整合到Nanodiscs中，保持其生物學(xué)活性，為膜蛋白研究提供了有力的技術(shù)支持，打通了膜蛋白研究中的瓶頸之一。
膜支架蛋白(MSPs)是載脂蛋白(apo) A-I的縮減版，它們包繞著脂質(zhì)雙分子層從而形成圓盤(pán)狀的結(jié)構(gòu)，即納米盤(pán)。其包含一個(gè)朝向內(nèi)部脂層的疏水面和朝外的親水面。這一結(jié)構(gòu)使得Nanodiscs在水溶液中具有很高的溶解度，同時(shí)在沒(méi)有去污劑的情況下也可以使膜蛋白溶解。
常用的磷脂為二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)或棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(POPC)，它們可以與(apo) A-I組裝成納米盤(pán)，并與溶解膜蛋白的去污劑膽酸鈉一起結(jié)合使用。
圖1：膜蛋白組裝到Nanodiscs的原理圖。綠色：膜支架蛋白（MSPs）；灰色：磷脂；橙色：膜蛋白。
根據(jù)所使用的MSPs的不同，形成的Nanodiscs的直徑會(huì)有所差異，這些納米級(jí)雙層微粒的直徑約為7-13納米。應(yīng)用廣泛的MSPs包括MSP1D1、MSP1D1-dH5和MSP1E3D1。具體尺寸見(jiàn)表1。
表1 不同類(lèi)型的MSPs的尺寸
2）為什么選擇Nanodiscs
在膜蛋白研究方面，尤其是配體結(jié)合研究、構(gòu)象動(dòng)力學(xué)分析以及蛋白相互作用的研究，Nanodiscs體系與其他體系相比有諸多優(yōu)勢(shì)。Nanodiscs可以使膜蛋白，如GPCRs或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等，在人造環(huán)境里和納米盤(pán)重新組裝起來(lái)，形成類(lèi)似天然的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。這種組裝到Nanodisc中的可溶性蛋白可以在沒(méi)有去污劑的情況下用常規(guī)的層析方法來(lái)進(jìn)行純化。（這個(gè)部分我們需要多查些資料看下）Nanodisc與膜蛋白的組裝結(jié)構(gòu)使得膜蛋白能夠在體外研究膜蛋白在生理上細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的兩面，因此也使得進(jìn)一步研究拮抗劑，激動(dòng)劑，G蛋白以及其他相互作用的配體等不再受限。
3）Nanodiscs優(yōu)勢(shì)：
Nanodiscs能夠?yàn)樘崛〕鰜?lái)的膜蛋白提供一個(gè)穩(wěn)定環(huán)境使它們繼續(xù)工作，就好像還沒(méi)有離開(kāi)原來(lái)細(xì)胞膜一樣。 細(xì)胞膜蛋白之所以研究難度大是在于膜蛋白從細(xì)胞膜上提取出來(lái)以后就無(wú)法行使其正常功能，使得研究這些受體分子相當(dāng)困難。為了解決這項(xiàng)難題，Stephen Sligar 等科學(xué)家研發(fā)出一種脂質(zhì)納米圓盤(pán) (lipid-based Nanodiscs)可以替代細(xì)胞膜上磷脂雙層膜 (phospholipid bilayer)，讓被純化出來(lái)的細(xì)胞膜蛋白如同一般細(xì)胞膜蛋白一樣穩(wěn)定地行使其正常功能。
Nanodiscs和天然的細(xì)胞膜的組成結(jié)構(gòu)一樣，是由兩層磷脂層組成的，每個(gè)磷脂分子都有活躍并親水的頭部基團(tuán)和疏水尾部。Nanodiscs 的結(jié)構(gòu)就像一般細(xì)胞膜一樣，由兩層背對(duì)背的磷脂 (phospholipid)所組成，為了使納米圓盤(pán)表面能保持這個(gè)扁平的形狀，研究人員給這個(gè)Nanodiscs 外面加上一圈蛋白質(zhì)(MSPs)。
Nanodiscs應(yīng)用前景非常廣泛，這個(gè)技術(shù)將有助于解開(kāi)一大堆未知的膜蛋白的生化行為模式，也將有可能幫助得到膜蛋白的結(jié)晶，從而應(yīng)用X 射線(xiàn)晶體衍射學(xué)獲得在原子水平上的結(jié)構(gòu)圖。
4）將膜蛋白組裝到Nanodiscs中的兩種方法：
方法1：組裝溶解在去污劑中的膜蛋白
在適合去污劑存在下，將膜蛋白溶解并純化，然后再添加MSPs和磷脂。含有膜蛋白的Nanodiscs能夠自發(fā)地組裝，在去除掉表面活性劑后可以通過(guò)凝膠過(guò)濾（排阻層析）等方式來(lái)純化。
方法2：Nanodiscs與無(wú)細(xì)胞表達(dá)體系相結(jié)合
另一個(gè)方法是，膜蛋白在無(wú)細(xì)胞表達(dá)體系中被表達(dá)，通過(guò)加入已經(jīng)和膜蛋白結(jié)合預(yù)先組裝的Nanodiscs，膜蛋白能通過(guò)無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出來(lái)。采用這種方法，就無(wú)需再添加去污劑，在很大程度上降低了人為添加試劑對(duì)結(jié)果的影響。
雖然通過(guò)無(wú)細(xì)胞表達(dá)體系會(huì)將蛋白的產(chǎn)量限制在微克級(jí)別，但這種方式卻為蛋白修飾，如生物素?；蛲凰貥?biāo)記等研究手段提供了更多發(fā)展方向的可能性。
圖2：膜蛋白與Nanodisc的兩種組裝機(jī)制
左圖：膜蛋白（橙色）溶解在去污劑（深灰色）中并與凍干的MSP（綠色）和磷脂（淺灰）混合。然后去除去污劑，形成蛋白-Nanodisc復(fù)合物。
右圖：預(yù)組裝了MSP與磷脂的Nanodiscs加入到無(wú)細(xì)胞反應(yīng)液（cell-free expression systems）中，新生的膜蛋白能夠自發(fā)地組裝到Nanodiscs中。
5）Nanodiscs的應(yīng)用
Nanodiscs為膜蛋白在體外提供了非常穩(wěn)定的環(huán)境，并且可以在這個(gè)環(huán)境下研究配體的結(jié)合，或用NMR和SPR研究拮抗劑與激動(dòng)劑。MSPs可以與組氨酸標(biāo)簽結(jié)合來(lái)促進(jìn)純化、檢測(cè)和固定化。
Nanodiscs其他方面的應(yīng)用還包括共振拉曼（resonance Raman），低溫電子顯微學(xué)(Cryo-EM)，MALDI ，蛋白活性研究和時(shí)間分辨熒光光譜。將抗原組裝到Nanodiscs中已經(jīng)被用來(lái)提高小鼠的免疫反應(yīng)，說(shuō)明其具備用于制備疫苗和生產(chǎn)抗體的極大潛能。最近，大腸桿菌全細(xì)胞膜蛋白組被組裝到了Nanodiscs中，為以后的研究構(gòu)建了一個(gè)可溶解的膜蛋白信息庫(kù)。表2中例舉了很多Nanodiscs的應(yīng)用。
表2 Nanodiscs應(yīng)用舉例
在過(guò)去幾年里，業(yè)內(nèi)已經(jīng)發(fā)表了多篇關(guān)于Nanodiscs的應(yīng)用文獻(xiàn)，例如：Nanodisc系列產(chǎn)品MSP1D1-His和MSP1D1dH5-His的應(yīng)用已刊登在《美國(guó)化學(xué)會(huì)-應(yīng)用材料與界面》（ACS Applied Materials & Interfaces），Cube Biotech科學(xué)家Dr. Barbara Maertens、法蘭克福大學(xué)生物物理化學(xué)研究所 Dr. Frank Bernhard和Dr. Erik Henrich在Springer旗下的BIOspektrum期刊聯(lián)合發(fā)表文章并提出Cube Biotech 研制的Nanodisc(納米磷脂盤(pán))是用于高效提取膜蛋白以及研究膜蛋白結(jié)構(gòu)/功能的新工具。目前，許多研究人員正在利用這項(xiàng)新技術(shù)研究出更多與之相關(guān)的技術(shù)與應(yīng)用。
圖3：有關(guān)Nanodiscs的文獻(xiàn)發(fā)表情況。從2003—2013年，利用Nanodiscs進(jìn)行膜蛋白研究的相關(guān)報(bào)道在不斷增加。（來(lái)源：PubMed）
6）獲得Nanodiscs
Cube Biotech提供四種尺寸的Nanodiscs,其由四種MSPs(MSP1D1/MSP1D1-dH5/MSP1E3D1/ MSP2N2)來(lái)實(shí)現(xiàn)、Nanodiscs試劑盒(包含MSP、磷脂和膽酸鈉)和預(yù)組裝的Nanodiscs。
產(chǎn)品列表：
Cube Biotech
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