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YF®647A-Annexin V/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒

貨號：AF2021-100T

儲存條件： 4℃避光冷藏，請勿凍存。

產(chǎn)品組分

光譜特性

YF®647A-Annexin V：Ex/Em = 650/665 nm

PI：Ex/Em = 535/617 nm (with DNA)

產(chǎn)品簡介

YF®647A-Annexin V和PI凋亡試劑盒提供了一種快速簡便的方法，通過標(biāo)記早期凋亡細(xì)胞（遠(yuǎn)紅）和壞死細(xì)胞（紅色），用于檢測細(xì)胞凋亡水平。產(chǎn)品可以使用流式細(xì)胞儀或其它熒光檢測設(shè)備進(jìn)行檢測。

YF®647A-Annexin V 可以標(biāo)記凋亡細(xì)胞。Annexin V 選擇性結(jié)合磷酯酰si氨酸（phosphatidylserine，簡稱 PS）。在細(xì)胞發(fā)生早期凋亡時(shí)，磷酯酰si氨酸會外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。用遠(yuǎn)紅熒光探針 YF®647A 標(biāo)記的 Annexin V，即 YF®647A-Annexin V，可以結(jié)合外翻的磷酯酰si氨酸，從而檢測細(xì)胞凋亡的重要特征。 YF®647A 染料與熒光素/FITC 相比，熒光亮度更高，且不受環(huán)境中 pH 的影響，具有良好的光穩(wěn)定性。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種 DNA 結(jié)合染料，它可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞的細(xì)胞核。PI 可以由 488，532 或 546 nm 的激光激發(fā)，呈現(xiàn)紅色熒光。

使用方法

下列實(shí)驗(yàn)方案以星形孢菌素誘導(dǎo) Jurkat 細(xì)胞凋亡為例。如果使用其他誘導(dǎo)劑和其他類型的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)條件需要調(diào)整。

1．流式細(xì)胞檢測

（1）根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。檢測樣品中應(yīng)包含未經(jīng)處理的細(xì)胞樣品，作陰性對照；一組樣品做單染，用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。

（2）收集細(xì)胞。

懸浮細(xì)胞：300 g，4℃離心5 min收集細(xì)胞；

貼壁細(xì)胞：用不含EDTA的yi酶消化后300 g，4℃ 離心5 min收集細(xì)胞，yi酶消化時(shí)間不宜過長，以防引起假陽性。

注：細(xì)胞用yi蛋白酶消化后，在最佳培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中恢復(fù)約30 min后染色，避免假陽性。

（3）用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，300 g，4℃下離心5 min，收集1-5×10⁵個(gè)細(xì)胞并用100 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。

（4）每管加入4-5 μL的YF®647A -Annexin V和5 μL的PI工作液。

注：推薦準(zhǔn)備兩管額外的細(xì)胞，每管只加入一種單染染料 （YF®647A-Annexin V 和 PI），用于流式單染的補(bǔ)償調(diào)節(jié)。

（5）室溫避光孵育10-15 min，為避免細(xì)胞凋亡進(jìn)程，孵育過程可在冰上操作。

（6）每管加入400 μL的PBS或1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞（PBS 或1× 結(jié)合緩沖液的選擇根據(jù)不同凋亡處理以及不同細(xì)胞具體選擇），盡快通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。 YF®647A-Annexin V可以由647 nm激光激發(fā)，檢測熒光發(fā)射光譜約在647 nm處（APC通道），PI發(fā)射光譜約在617 nm處。

2．熒光顯微鏡檢測

（1）將細(xì)胞接種在蓋玻片或載玻片小室中。

（2）根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。檢測樣品中應(yīng)包含未經(jīng)處理的細(xì)胞樣品，作為陰性對照。

（3）用PBS洗滌細(xì)胞。

注：可以用含血清的培養(yǎng)基直接替代Annexin V結(jié)合緩沖液，但是Annexin V的使用濃度需要重新優(yōu)化。建議梯度測試。

（4）每100 μL的Annexin V結(jié)合緩沖液中加入5-25 μL的 YF®647A-Annexin V和5 μL的PI。

注：最佳使用濃度由具體實(shí)驗(yàn)要求確定。

（5）向培養(yǎng)板中加入足量的染液以覆蓋全部細(xì)胞，室溫避光孵育15-30 min。為降低細(xì)胞凋亡進(jìn)程，孵育過程可在冰上

操作，但孵育時(shí)間至少延長至30 min。

（6）用1×結(jié)合緩沖液清洗細(xì)胞。

（7）將孵育有細(xì)胞的蓋玻片置于載玻片上，載玻片可提前加一滴1×結(jié)合緩沖液；對于培養(yǎng)在小室內(nèi)的細(xì)胞，可直接加入足量的1×結(jié)合緩沖液覆蓋細(xì)胞。

（8）使用合適的濾光片在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。 YF®647A-Annexin V 可用 APC 適用的濾光片，PI 可用 Cy3或者 Texas 濾光片。

注意事項(xiàng)

1. 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

3. 本產(chǎn)品僅用于科研 。