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一、概述-- Xenium組織空間原位多組學(xué)分析系統(tǒng)

這是一臺高度自動化、高通量的組織原位分析技術(shù)平臺，幫助用戶實現(xiàn)亞細(xì)胞分辨率的靶向基因和蛋白表達(dá)原位分析。它在10x Genomics早期收購的ReadCoor和Cartana的基礎(chǔ)技術(shù)之上做了大量研發(fā)和改進(jìn)。Xenium將單分子RNA和蛋白檢測的功能與強(qiáng)大的光學(xué)元件、數(shù)據(jù)采集和解碼技術(shù)相結(jié)合，能夠以亞細(xì)胞分辨率在整張切片上快速檢測大量靶點的組織原位表達(dá)水平。該平臺可以兼容多種樣品類型，包括新鮮冷凍（FF）組織和福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織。Xenium平臺擁有一條不斷拓展的產(chǎn)品路線圖，不斷增強(qiáng)核心平臺的分析能力和分析物種類，比如一張切片同時檢測RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。品牌10x Genomics，型號Xenium In Situ，產(chǎn)地新加坡，代理商是斑馬魚（北京）科技有限公司，從組織制備到數(shù)據(jù)分析，該平臺將會得到技術(shù)專家團(tuán)隊的全.方位支持。

二、平臺概覽 The Xenium In Situ platform

有了Chromium和Visium等分析，研究人員能夠分別檢測單個細(xì)胞或整張組織切片的全轉(zhuǎn)錄組。在后續(xù)研究中，他們可以采用靶向原位分析技術(shù)，這不僅能夠在組織細(xì)胞生物學(xué)狀態(tài)下對細(xì)胞進(jìn)行定位和分型，還能夠針對先前從Chromium和Visium數(shù)據(jù)中獲得的信息來詳細(xì)研究各種具體問題。

Xenium平臺可幫助科學(xué)家展示、定量和分析固定在載玻片上的FF和FFPE組織切片中的基因表達(dá)和蛋白豐度。還將提供一系列針對不同組織類型和應(yīng)用場景的試劑菜單選項，以及添加客戶定制靶點的選項，從而實現(xiàn)對目標(biāo)靶點進(jìn)行高靈敏度的原位分析。

這是一個端對端的完整解決方案，包含一臺強(qiáng)大的可實現(xiàn)高通量分析的全自動儀器，提供機(jī)載分析功能，可處理圖像數(shù)據(jù)，定位RNA和蛋白信號，并開展二級分析。您也可以輕松地傳輸數(shù)據(jù)，使用10x Genomics提供的軟件或您選擇的第三方軟件工具進(jìn)行分析可視化。

三、工作流程概覽

Xenium工作流程從在Xenium載玻片上制備組織切片開始（圖1）。對切片進(jìn)行處理以暴露出易于雜交的RNA和蛋白質(zhì)分子，并分別用可環(huán)化的DNA探針和帶有DNA標(biāo)簽序列的抗體進(jìn)行雜交標(biāo)記。DNA探針的兩側(cè)帶有兩個目標(biāo)RNA特異性的獨立雜交的區(qū)域。它們還包含基因特異性的標(biāo)簽序列。每對探針末端在與目標(biāo)RNA區(qū)域雜交后會連接產(chǎn)生可酶促擴(kuò)增的環(huán)狀DNA探針。這種連接設(shè)計確保了每對探針與目標(biāo)RNA區(qū)域雜交的高特異性。蛋白質(zhì)檢測將是該平臺未來將拓展的一項功能，它將采用熒光探針雜交標(biāo)記蛋白的DNA條碼序列來檢測組織切片中每種標(biāo)記蛋白的表達(dá)水平。

每次實驗中，可將最多兩張載玻片放入Xenium分析儀內(nèi)。結(jié)合在RNA上的擴(kuò)增后的DNA環(huán)狀探針與熒光標(biāo)記的已知短序列探針結(jié)合，產(chǎn)生明亮、易于成像且信噪比高的信號。樣本經(jīng)過連續(xù)幾輪的熒光探針雜交、成像和去除。接著生成每個基因特異性的熒光特征條碼，從而實現(xiàn)目標(biāo)基因的定位和識別。通過熒光探針與抗體上DNA標(biāo)簽序列的雜交可進(jìn)一步檢測蛋白質(zhì)，并構(gòu)建出整張組織切片上轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)的全景空間表達(dá)圖譜。然后，通過細(xì)胞核染色，確定細(xì)胞核膜位置、形態(tài)來推斷細(xì)胞邊界，或通過細(xì)胞形態(tài)染色來確定細(xì)胞邊界。最后將細(xì)胞邊界信息映射到RNA和蛋白表達(dá)圖像上，并將轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)根據(jù)位置坐標(biāo)分配給每個細(xì)胞。

四、Xenium平臺

1.樣本制備

Xenium工作流程與FF組織和FFPE組織都兼容，首先是在Xenium載玻片制備所需組織的切片。這些切片經(jīng)過脫蠟和透化等處理，讓RNA和蛋白分析物暴露出來。RNA與可環(huán)化的DNA探針雜交結(jié)合，該探針包含兩個與目標(biāo)RNA特異性雜交的區(qū)域以及另一個基因特異性標(biāo)簽序列區(qū)域。探針的兩端與目標(biāo)RNA雜交結(jié)合，通過連接兩端后產(chǎn)生環(huán)狀DNA探針。如果探針發(fā)生非特異雜交或脫靶，則不會發(fā)生連接反應(yīng)，從而抑制非特異性信號并確保高特異性。未來的蛋白檢測功能將采用熒光探針雜交標(biāo)記抗體的DNA標(biāo)簽序列來檢測組織切片中每種被標(biāo)記蛋白的表達(dá)水平。DNA探針連接后，環(huán)化探針經(jīng)過酶促擴(kuò)增，生成每個RNA雜交事件的基因特異性標(biāo)簽序列的多個拷貝。這會產(chǎn)生更強(qiáng)的信號，易于成像分析且信噪比高，這在分析自發(fā)熒光背景高的樣本（如FFPE組織）時尤其重要。

2. Xenium分析儀上的解碼流程

Xenium分析儀（圖2）是全自動的，帶有數(shù)據(jù)并行處理功能，可快速輸出數(shù)據(jù)，幫助用戶及時進(jìn)行數(shù)據(jù)分析解讀。儀器內(nèi)置成像系統(tǒng)使用高數(shù)值孔徑(NA)以及帶有低噪聲傳感器的快速區(qū)域掃描照相機(jī)，可實現(xiàn)約200 nm的像素分辨率。它的視場為600 x 900 μm，Z軸多層光切圖像是在整個組織厚度上以0.75 μm的步長逐一獲得的。FFPE組織切片的常見厚度通常為5μm，而FF組織切片厚度為10 μm。采集的圖像可通過Xenium分析軟件進(jìn)行處理，以實現(xiàn)sub-50 nm定位分辨率的單分子水平檢測。此外，該儀器還集成了樣本處理、液路和寬場熒光顯微鏡成像系統(tǒng)。Xenium分析儀一次運行最多可上樣兩塊載玻片，每塊玻片的可成像分析區(qū)域面積約為12 x 24 mm。這樣大小的成像分析面積讓科學(xué)家能夠靈活地在每塊載玻片上放置多張切片和多個樣本。分析物檢測和圖像采集分析是在Xenium分析儀上按逐個循環(huán)進(jìn)行的。試劑耗材（包括檢測RNA和蛋白質(zhì)分子的熒光標(biāo)記探針）在儀器內(nèi)全自動運行每個循環(huán)、孵育、成像和移除。

在熒光標(biāo)記的探針與擴(kuò)增后的基因特異性標(biāo)簽序列結(jié)合后，樣本會經(jīng)歷連續(xù)幾輪的熒光探針雜交、成像和探針移除。對于分析物檢測，在此過程的每個循環(huán)中，每個標(biāo)簽序列，也就是每個RNA的標(biāo)記，都以特定的顏色打開或關(guān)閉。這會產(chǎn)生每個基因特異性的熒光特征條碼。在讀取這個打開或關(guān)閉的熒光特征條碼后，軟件可解碼出所有目標(biāo)基因的身份。在儀器結(jié)束運行時，系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整合，并構(gòu)建整張組織切片上轉(zhuǎn)錄本的空間圖譜。成像系統(tǒng)使用高數(shù)值孔徑以及帶有低噪聲傳感器的快速區(qū)域掃描照相機(jī)，實現(xiàn)高靈敏度和高分辨率的原位分析。

3. 基因和蛋白靶向試劑

Xenium平臺使用靶向試劑組合在亞細(xì)胞分辨率水平檢測組織原位基因和蛋白表達(dá)量。使用組織和應(yīng)用特異性基因組合，并支持額外客戶定制基因選項，將是解決不同類型樣本中基因和蛋白表達(dá)多樣性和差異性的最好策略。商業(yè)基因組合試劑是經(jīng)過大量數(shù)據(jù)挖掘甄選后構(gòu)建的，綜合了全面的單細(xì)胞圖譜研究結(jié)果以及各個研究領(lǐng)域?qū)＜业娜斯徍撕蛯氋F建議。

基因組合

10x Genomics正在針對某些組織和應(yīng)用開發(fā)商業(yè)試劑的基因組合菜單。這些模塊化的組合可分開或組合使用，可以更好的支持各個項目的個性化需求。每個Xenium基因組合預(yù)計包含幾百個基因，并且可針對每個項目進(jìn)行定制，目前計劃最多可添加50個客戶定制基因。商業(yè)試劑組合定制基因組合的最初的最大多重檢測能力為400個基因。Xenium平臺本身是為1,000個基因的多重檢測能力而開發(fā)的。未來的產(chǎn)品擴(kuò)展將讓Xenium基因組合適用于更多物種、組織和研究應(yīng)用方向。最終也將有望根據(jù)研究人員的需求提供更多客戶定制功能。

蛋白質(zhì)組合

未來的產(chǎn)品線擴(kuò)展將增加蛋白質(zhì)組合，作為Xenium產(chǎn)品線的一部分。

4. 軟件系統(tǒng)——數(shù)據(jù)管理和分析

Xenium平臺包含機(jī)載分析功能，能夠處理圖像數(shù)據(jù)，定位分析物信號，并開展二級分析，以便將分析的靶點表達(dá)信息分配給不同細(xì)胞，生成分析物表達(dá)譜——細(xì)胞矩陣。二級分析使用細(xì)胞核和細(xì)胞形態(tài)信息來鑒定組織切片上的細(xì)胞邊界。機(jī)載分析與儀器運行并行開展，實現(xiàn)最短運轉(zhuǎn)周期。Xenium整體解決方案還將包含基因組合探針設(shè)計工具，以便完成上游實驗設(shè)計和個性化實驗定制功能。

Xenium解決方案還包含了用于下游分析的數(shù)據(jù)分析管線和可視化工具，讓科學(xué)家能夠探索和挖掘Xenium數(shù)據(jù)。這將幫助科學(xué)家能夠快速獲取可分析、解釋的組織原位分析數(shù)據(jù)。Xenium分析儀產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可輕松從儀器中下載、轉(zhuǎn)移出來，并與對應(yīng)的組織形態(tài)和細(xì)胞邊界等信息結(jié)合分析，通過10x Genomics提供的軟件進(jìn)行可視化和進(jìn)一步分析。此外，數(shù)據(jù)還可以開放的標(biāo)準(zhǔn)文件格式輸出，便于研究人員使用第三方軟件和專業(yè)研究者開發(fā)的高階工具進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

5. 技術(shù)培訓(xùn)和支持

10x產(chǎn)品包括Xenium、Visium CytAssist、Chromium Controller，Chromium X、Chromium™ Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit、Visium Spatial for FFPE Gene Expression Kit、Chip G、Feature Barcode Library Kit……斑馬魚（北京）科技有限公司是10x Genomics代理商，負(fù)責(zé)銷售儀器和試劑，具備豐富的單細(xì)胞測序和空間轉(zhuǎn)錄組實驗方面經(jīng)驗，可為用戶提供單細(xì)胞懸液制備，建庫，測序，生信分析等一整套解決方案。在購買Xenium分析儀后，將安排有資質(zhì)的工程師進(jìn)行現(xiàn)場安裝和培訓(xùn)。培訓(xùn)內(nèi)容包括樣本制備、儀器操作、數(shù)據(jù)分析。在培訓(xùn)完成后，客戶還將獲得全.方位支持，包括遠(yuǎn)程技術(shù)支持（Technical Support）、現(xiàn)場應(yīng)用科學(xué)家（FAS）、現(xiàn)場服務(wù)工程師（FSE）和生物信息學(xué)應(yīng)用（Applied Bioinformatics）團(tuán)隊，覆蓋實驗工作流程、試劑耗材、儀器和軟件的各個方面。

6. 基礎(chǔ)技術(shù)

Xenium技術(shù)建立在收購ReadCoor和Cartana公司而獲得的專.利技術(shù)基礎(chǔ)之上，這兩家公司分別由George Church和Mats Nilsson實驗室開發(fā)并商業(yè)化而來，Xenium技術(shù)同時融合了10x Genomics自主開發(fā)的專.利技術(shù)。綜合以上各種基礎(chǔ)技術(shù)產(chǎn)生的10x Genomics專有的原位分析技術(shù)在靈敏度、特異性和樣品通量方面都比原來基礎(chǔ)技術(shù)提高了數(shù)倍。

五、代表性的數(shù)據(jù)

以下這些數(shù)據(jù)集，是使用Xenium分析儀和200基因的人類乳腺癌基因組合從FFPE包埋的人類浸潤性乳腺癌組織切片上生成的，并與同一組織塊的蘇木精和伊紅（H&E）染色切片進(jìn)行比較，H&E染色切片之前由病理學(xué)家進(jìn)行了切片注釋，并通過Visium FFPE技術(shù)進(jìn)行了檢測和分析。

1. Xenium數(shù)據(jù)

使用包含200個基因組合試劑對人類浸潤性乳腺癌FFPE組織進(jìn)行分析。分析后生成了一幅轉(zhuǎn)錄本的空間圖譜，每個RNA轉(zhuǎn)錄本帶有x、y和z坐標(biāo)。通過DAPI染色確定細(xì)胞核邊界，并通過擴(kuò)展細(xì)胞核邊緣來估算細(xì)胞邊界（圖3）。所有RNA轉(zhuǎn)錄本被分配到特定細(xì)胞中，并生成gene-by-cell矩陣。根據(jù)每個細(xì)胞的RNA含量和基因組合中的標(biāo)志物識別細(xì)胞類型。例如，ERBB2可用來鑒定腫瘤細(xì)胞，而編碼核心蛋白聚糖的DCN可用來鑒定基質(zhì)細(xì)胞。淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可通過特定CD標(biāo)志物來鑒定。按照分配的細(xì)胞類型對不同細(xì)胞進(jìn)行不同色彩標(biāo)識。這就產(chǎn)生了按細(xì)胞類型來區(qū)分的細(xì)胞空間表達(dá)圖譜，每個細(xì)胞內(nèi)有分配到該細(xì)胞的全部靶向RNA轉(zhuǎn)錄本。

2. 關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)比較

來自同一乳腺癌FFPE組織塊切片的H&E染色結(jié)果顯示出獨.特的腫瘤特征。病理學(xué)家對該FFPE切片的注釋，確定了浸潤腫瘤被各種纖維組織、脂肪組織和腫瘤壞死區(qū)域環(huán)繞。Xenium數(shù)據(jù)與病理學(xué)家注釋的浸潤癌的特征具有很好的相關(guān)性（圖4）。

接著使用Visium FFPE空間基因表達(dá)分析對同一組織切片進(jìn)行處理，以便將通過Visium數(shù)據(jù)觀察到的空間表達(dá)圖譜分布與通過Xenium獲得的原位表達(dá)圖譜進(jìn)行比較。我們發(fā)現(xiàn)，使用Visium數(shù)據(jù)（通過NGS測序得到的數(shù)據(jù)）和Xenium數(shù)據(jù)（通過顯微鏡以亞細(xì)胞分辨率檢測得到的數(shù)據(jù)）觀察到的基因空間分布之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性（圖4）。

綜上，這些數(shù)據(jù)表明，Xenium平臺可以很好地重現(xiàn)病理學(xué)家注釋的H&E染色圖像的細(xì)胞分型和病理區(qū)域注釋，并可以高分辨率驗證使用Visium平臺觀察到的基因表達(dá)空間分布。

六、主要應(yīng)用場景

使用Xenium組織空間原位多組學(xué)分析系統(tǒng)，研究人員能夠通過亞細(xì)胞分辨率的多重RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)檢測加深對健康和病變組織的了解。主要應(yīng)用在以下方面：

• 繪制阿爾茨海默病的細(xì)胞類型圖譜(1)

• 根據(jù)多種細(xì)胞類型的多個標(biāo)志物基因?qū)M織切片進(jìn)行空間原位解析(2,3)

• 對復(fù)雜發(fā)育過程及背后的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)進(jìn)行時空組學(xué)原位解析(4)

• 對單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)進(jìn)行組織切片原位驗證，原位分析結(jié)果可以加深對組織亞結(jié)構(gòu)分子基礎(chǔ)的進(jìn)一步了解(5)

以上文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)僅代表原位技術(shù)的一般應(yīng)用，不代表10x Genomics Xenium平臺的靈敏度和分辨率。自從收購了Cartana和ReadCoor兩家原位測序技術(shù)公司以來，10x Genomics投入大量人力物力對上述范例中描述的原位技術(shù)進(jìn)行持續(xù)的開發(fā)和改進(jìn)。Xenium分析儀將以上兩種基礎(chǔ)原位測序技術(shù)與10x Genomics專有改進(jìn)方案相結(jié)合，提供了一個分辨率和靈敏度比上述已發(fā)表數(shù)據(jù)更高的全新平臺。Xenium還顯著改進(jìn)了原位分析技術(shù)的易用性和數(shù)據(jù)生成時間。

七、使用Xenium平臺開展原位分析研究的理由

Xenium組織空間原位多組學(xué)分析系統(tǒng)具有許多技術(shù)優(yōu)勢，已成為以亞細(xì)胞分辨率分析多重空間基因表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)的理想產(chǎn)品。該平臺的核心是全自動和高通量的Xenium分析儀，可以自動進(jìn)行探針標(biāo)記、成像和機(jī)載數(shù)據(jù)分析等全流程功能。

• 強(qiáng)大而靈活的核心平臺——Xenium是一個強(qiáng)大而靈活的核心平臺，適用于各種組織、樣本類型和應(yīng)用。此外，該平臺的設(shè)計理念是未來可不斷增添新功能，包括額外的組織特異性和疾病特異性的基因組合、同一切片上RNA和蛋白質(zhì)的同時檢測，以及同時檢測1,000種分析物的多重分析能力。

• 起始樣本的靈活性——Xenium技術(shù)流程可以兼容新鮮冷凍組織（FF）和福爾馬林固定石蠟包埋組織（FFPE）樣品。

• 多重分析和亞細(xì)胞分辨率——Xenium平臺能夠以亞細(xì)胞分辨率檢測多達(dá)400個RNA轉(zhuǎn)錄本（初上市時），并有望在未來實現(xiàn)多達(dá)1,000個分析物的同時檢測。

• 具有定制功能的人工審核基因組合——Xenium平臺可使用商業(yè)試劑的基因組合，這些基因組合是經(jīng)過大量數(shù)據(jù)挖掘甄選后構(gòu)建的，綜合了全面的單細(xì)胞圖譜研究結(jié)果以及各個研究領(lǐng)域?qū)＜业娜斯徍撕蛯氋F建議。Xenium基因組合能夠增加定制基因集合，這些基因組合在交付后可立即用于Xenium分析。此外，10x Genomics還致力于不斷擴(kuò)展商業(yè)試劑供應(yīng)的Xenium基因組合菜單種類，逐步會包含更多的組織和應(yīng)用類型。

• 輕松易用的流程——Xenium平臺是一個輕松易用的完整解決方案，包含制備樣本所需的試劑和Xenium分析儀上配合圖像采集需要的試劑，以及用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析、可視化和數(shù)據(jù)解讀的10x Genomics軟件。

• 超大通量——Xenium分析儀可在成像區(qū)域內(nèi)開展超高重靶點組織全景分析。每塊Xenium載玻片上有一個大的可成像區(qū)域（12 x 24 mm），單次運行可同時加載和分析兩張切片。單次樣品通量由可成像區(qū)域內(nèi)包含的組織切片數(shù)量決定。例如，如果組織切片的大小為10 mm x 10 mm，則每塊載玻片可容納兩張切片，并且單次運行可同時分析四張切片。儀器運行大約需要兩天的時間，每周通量為12張組織切片/周，以此類推，分析樣品組織切片越小，單周內(nèi)可分析的樣品數(shù)目會顯著增加。

• 全面的數(shù)據(jù)分析解決方案——10x Genomics提供數(shù)據(jù)分析流程用于數(shù)據(jù)分析和再分析，并提供先進(jìn)的軟件用于數(shù)據(jù)可視化分析。Xenium分析儀產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可輕松從儀器中轉(zhuǎn)移出來，并與基本組織形態(tài)、細(xì)胞邊界信息等結(jié)合用于可視化分析。10x Genomics提供的軟件支持進(jìn)一步高階分析。數(shù)據(jù)以行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的文件格式提供，讓科學(xué)家可自由使用他們選擇的各類分析工具。

• 細(xì)胞類型分配——10x Genomics軟件將每個檢測到的轉(zhuǎn)錄本或蛋白質(zhì)分配給單個細(xì)胞，讓科學(xué)家能夠根據(jù)他們選擇的基因組合對細(xì)胞類型進(jìn)行分子水平注釋。

• 全面專業(yè)的支持資源——10x Genomics提供全面的支持資源，既包括我們的技術(shù)支持科學(xué)家、現(xiàn)場應(yīng)用科學(xué)家、現(xiàn)場服務(wù)工程師和生物信息學(xué)應(yīng)用科學(xué)家，他們都接受過Xenium流程、儀器和分析的專業(yè)培訓(xùn)，也包括免費提供的視頻和技術(shù)文檔，這些可幫助指導(dǎo)新用戶順利完成Xenium實驗流程。

• 產(chǎn)品質(zhì)量認(rèn)證——10x Genomics的產(chǎn)品開發(fā)和制造流程已通過ISO 9001:2015認(rèn)證。

八、斑馬魚（北京）科技有限公司，是10x Genomics公司的授權(quán)經(jīng)銷商，負(fù)責(zé)產(chǎn)品的推廣銷售和技術(shù)支持，為您提供技術(shù)參數(shù)，報價、選型、實驗指導(dǎo)、安裝培訓(xùn)、售后服務(wù)等，更多信息可和我們聯(lián)系。