作者將N末端的人RNase H1蛋白通過表面修飾的方法固定在原子力顯微鏡針尖上。這種蛋白可以結(jié)合RNA/DNA雜交雙鏈，稱為雜交結(jié)合域（hybrid binding domain, HBD），在這里作者使用結(jié)構更穩(wěn)定的DNA探針而不是RNA來檢測mRNA。在實驗中，修飾后的探針用于檢測一種腦特異性miRNA，miR-134。這是一種能夠調(diào)節(jié)脊椎生長和樹突生成的腦特異性miRNA。

為了驗證特異性的識別，作者首先將全部RNA從細胞中提取出來，并將其與固定在玻璃片上面積大約15-20平方微米的探針DNA斑點雜交。使用布魯克ForceRobot原子力顯微鏡²進行單分子力曲線測試，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)粘附力大約在20pN上下，解離距離大約3.8nm。通過對比修飾后探針與單鏈ssDNA，雙鏈dsDNA和雙鏈dsRNA斑點以及經(jīng)過RNase H處理后的斑點間的力曲線，可以確認這是一種特異性結(jié)合。在實驗中，可以發(fā)現(xiàn)當AFM掃描像素點尺寸在4nm時，miR134的粘附力圖為一個由34個像素點組成的團簇，并且在大多數(shù)像素點上觀察到特異性結(jié)合的概率不低于40%。這一團簇可以被擬合為一個橢圓，等效圓半徑14nm。這一尺寸與結(jié)合構型中的分子尺寸一致。通過是否產(chǎn)生粘附力團簇、特異性結(jié)合產(chǎn)生的概率即可判斷原子力顯微鏡探針是否檢測到了目標mRNA分子。

根據(jù)估計，單個miRNA種類在細胞中的平均拷貝數(shù)約為500。為了確保能在單個細胞中識別目標miRNA，作者使用FluidFM探針³制備了直徑為3-8 μ m的探針DNA斑點，通過將合成miR-134溶液（10-100 aM，40 μL中含有240-2400個拷貝）孵育在其中一個斑點上來評估識別效率。作者在每一個樣品的每一個斑點中的三個任意位置記錄粘附力數(shù)據(jù)并取平均值，計算了每個斑點上識別到的miR-134數(shù)目。通過線性回歸，作者計算出DNA斑點上miR-134的識別效率為78%。

在驗證了這一方法可以成功識別體外RNA后，作者進一步將這一方法應用于單個海馬體神經(jīng)細胞上。使用進行修飾后可以與miR-134互補的原子力顯微鏡探針，作者在神經(jīng)元體的隨機位置進行了力曲線測試。作者使用布魯克NanoWizard原子力顯微鏡⁴對MAP2免疫染色標記的神經(jīng)元在AC模式下進行成像，并選擇了三個位置進行粘附力測試（100×100像素，1.0×1.0 μm2），在同一位置得到細胞熒光圖像、原子力顯微鏡圖像與力曲線數(shù)據(jù)（圖4）。在神經(jīng)元體上，每個圖像中可以觀察到2-4個團簇。RNase H處理后同一區(qū)域中團簇的消失，這同樣證實了觀察到的粘附力曲線是具有特異性的。在固定的神經(jīng)元上，只有當探針DNA與目標RNA雜交時才觀察到合格的簇，而當互補RNA或亂序DNA雜交時則不會觀察到團簇，這與在玻璃片上DNA探針斑點上獲得的結(jié)果一致，即這一miRNA/DNA雜交是特異性檢測。

為了進一步驗證這種方法的準確性與特異性，作者還分析了在固定的神經(jīng)元上膜去極化誘導的miR-134表達變化。在固定前，海馬神經(jīng)元（DIV7）通過KCl（40 mM）處理2小時以誘導去極化。在受刺激的神經(jīng)元（1.0×1.0 μm2）的區(qū)域內(nèi)平均觀察到了9.9個團簇，而在未受刺激的對照神經(jīng)元中僅檢測到了2.7個簇（見圖5）。使用共聚焦顯微鏡觀察c-Fos的表達增加，進一步驗證了KCl刺激神經(jīng)元的效果。雖然需要進一步研究了解AFM探針的壓入深度和樣品制備的影響，但這種直接的AFM粘附力圖像觀察到的簇數(shù)增加與在DNA探針斑點上通過提取出RNA進行宏觀評估的結(jié)果一致。同一細胞上不同位置和同一條見下不同細胞間miR-134數(shù)量變化很小，證明了其在DIV7海馬體神經(jīng)元內(nèi)是全局性表達的。

作者通過建立了一種基于原子力顯微鏡的粘附力成像新型miRNA定量方法。這種方法的靈敏度足以在單個細胞中分析特定miRNA的拷貝數(shù)，而無需修飾、逆轉(zhuǎn)錄或擴增。同時可以實現(xiàn)單個miRNA的原位測試。結(jié)合AFM的高分辨率特性，這種方法同樣適用于神經(jīng)元的其他區(qū)域，如樹突和突觸。如果借助快速原子力顯微鏡，將能夠高效地可視化單個細胞的整個表面。此外，使用固定細胞和組織的切片能夠檢查細胞的內(nèi)部和特定的細胞亞結(jié)構。這種新的分析方法為理解miRNA的生物學作用及其細胞間變異提供了新的途徑。在生物樣品中檢測少量的miRNA生物標志物將使得這種方法能夠作為一種可行的癌癥診斷工具。