福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE) 的組織樣本是世界各地病理實驗室保存臨床組織樣本的標準方法。隨著核酸測序技術的發(fā)展引起了人們對使用生物庫中存儲的歷史FFPE樣本的興趣。然而，福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本在制備過程中會對DNA造成顯著損傷，這些損傷包括：DNA分子鏈斷裂，DNA高度片段化、核酸與蛋白質交聯(lián)、胞嘧啶脫氨基，即FFPE樣本中的胞嘧啶（C）可能脫氨基變成尿嘧啶（U）、氧化損傷、DNA的3'端被封閉、DNA-蛋白質交聯(lián)。這些損傷會導致從FFPE樣本中提取的DNA質量較差，從而影響下游應用，如PCR擴增、測序等。

為了解決這些問題，一種方法是采用修復試劑盒，如Hieff NGS® FFPE DNA Repair Reagent（Cat#12606），另一種方法是采用Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase對含有尿嘧啶的受損DNA模板中進行高保真擴增。

PCR技術使生命科學領域和研究手段發(fā)生了革命性的變化，與DNA克隆、DNA重組、DNA測序、RNA干擾等分子生物學技術一樣，成為生物學和醫(yī)學科學研究領域乃至臨床疾病診斷的工具。但是擴增產(chǎn)物的污染，是PCR反應中最主要的污染問題，因為PCR產(chǎn)物拷貝量大（一般為1013copies/ml)，遠遠高于PCR檢測拷貝的上限，所以極微量的PCR產(chǎn)物氣溶膠，就可能造成假陽性。對于qPCR、RT-qPCR的擴增酶為Taq酶，Taq酶具有耐U的功能，常搭配UDG酶一起使用，Taq酶不具有高保真性，在一些需要保真度高的應用中Taq酶就無法勝任，如針對病原基因組的擴增測序，此時需要采用Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase搭配UDG酶進行防污染的高保真擴增。UDG 酶即可將反應體系中已有的dU的DNA污染物中的尿嘧啶堿基降解，并在隨后變性這步的條件下 DNA 鏈斷裂，消除由于污染DNA產(chǎn)生的擴增，從而保證擴增結果的特異性，準確性。

基于尿嘧啶切除的克隆依賴于含有重疊序列的PCR產(chǎn)物進行無縫組裝，不需要依賴限制性內(nèi)切酶和連接酶，可用于多個PCR片段的組裝、核苷酸序列的修改以及定向克隆。具體操作流程為：

圖4.基于尿嘧啶切除的克隆示意圖