免疫熒光技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟與優(yōu)缺點(diǎn)
免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence,IF)又稱熒光抗體技術(shù),是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán),再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位。
原理:免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素,制成熒光抗體,再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素,利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光(黃綠色或橘紅色),可以看見熒光所在的組織細(xì)胞,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。
一、操作步驟:
1、細(xì)胞準(zhǔn)備:對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞,在傳代培養(yǎng)時(shí),將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片,PBS洗兩次;對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞,用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次,用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。
1、固定:根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。PBS洗滌3×5 min.
2、通透:使用交聯(lián)劑(如多聚甲醛)固定后的細(xì)胞,一般需要在加入抗體孵育前,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理,以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.
3、封閉:使用封閉液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉,時(shí)間一般為30min.
4、一抗結(jié)合:室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次,每次沖洗5min.
5、二抗結(jié)合:間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次,每次沖洗5min后,再用蒸餾水漂洗一次。
二、優(yōu)缺點(diǎn):
優(yōu)點(diǎn):
1、高靈敏度:免疫熒光技術(shù)對(duì)抗原的檢測(cè)具有很高的靈敏度,即使在極微量的抗原存在下也能進(jìn)行檢測(cè)。
2、高特異性:由于抗體與抗原的特異性結(jié)合,免疫熒光技術(shù)可以準(zhǔn)確地定位和檢測(cè)特定的蛋白質(zhì)或抗原。
3、可視化:該技術(shù)允許直接在細(xì)胞或組織中觀察靶標(biāo)抗原,提供了直觀的視覺信息,有利于了解抗原的分布和定位。
4、雙重標(biāo)記:可以同時(shí)使用兩種不同的熒光標(biāo)記抗體,以在同一樣本中檢測(cè)兩種不同的抗原,這對(duì)于共定位研究非常有用。
5、適用性廣:免疫熒光技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究,包括疾病診斷、細(xì)胞分選、蛋白質(zhì)相互作用和細(xì)胞生物學(xué)研究。
6、可定量:通過測(cè)量熒光強(qiáng)度,可以對(duì)抗原表達(dá)進(jìn)行定量分析。
7、快速:一旦制備好樣品和抗體,免疫熒光實(shí)驗(yàn)通常可以在幾小時(shí)內(nèi)完成。
缺點(diǎn):
1、信號(hào)衰減:熒光信號(hào)會(huì)隨時(shí)間衰減,尤其是在長(zhǎng)時(shí)間曝光于激發(fā)光下,這要求在實(shí)驗(yàn)過程中及時(shí)捕獲圖像。
2、非特異性背景:可能會(huì)發(fā)生非特異性結(jié)合,需要通過適當(dāng)?shù)姆忾]和對(duì)照實(shí)驗(yàn)來減少背景信號(hào)。
3、熒光淬滅:在某些條件下,熒光標(biāo)記可能會(huì)淬滅,影響結(jié)果的可靠性。
4、需要特殊設(shè)備:免疫熒光顯微鏡和相關(guān)設(shè)備相對(duì)昂貴,可能不是所有實(shí)驗(yàn)室都能配備。
5、樣品制備:樣品固定和處理過程可能影響抗原的檢測(cè),需要仔細(xì)優(yōu)化條件。
6、不能保存長(zhǎng)久:由于熒光信號(hào)會(huì)隨時(shí)間衰減,因此無法長(zhǎng)期保存樣品進(jìn)行復(fù)查。
7、有限的多重分析能力:盡管可以進(jìn)行雙重或多重標(biāo)記,但可用的熒光通道數(shù)量有限,這限制了同時(shí)檢測(cè)不同抗原的數(shù)量。
8、解釋主觀性:結(jié)果的解釋可能具有主觀性,依賴于觀察者對(duì)熒光信號(hào)的識(shí)別和解釋。
9、光毒性:長(zhǎng)時(shí)間的光照可能對(duì)活細(xì)胞造成損傷,影響細(xì)胞生理狀態(tài)。
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