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傳統(tǒng)意義上，紅細(xì)胞和白細(xì)胞都是用電阻法計(jì)數(shù)的。這種方法測(cè)量的是當(dāng)分散在導(dǎo)電介質(zhì)中的粒子通過小孔時(shí)，電阻的增加或相反，電導(dǎo)率的減少。這種反應(yīng)的大小與粒子的體積和大小有關(guān)。盡管這項(xiàng)技術(shù)多年來一直適用，但本文證明，使用SPOS(單粒子光學(xué)傳感)結(jié)合自動(dòng)稀釋功能對(duì)紅細(xì)胞和白細(xì)胞的大小及顆粒計(jì)數(shù)檢測(cè)，可以比電阻法更易于使用和更少的稀釋劑限制。

AccuSizer 780利用光阻或單粒子光學(xué)傳感(SPOS)的原理來計(jì)數(shù)及檢測(cè)粒子大小，一次檢測(cè)一個(gè)粒子。單個(gè)粒子通過傳感器，并進(jìn)入激光帶。當(dāng)它們進(jìn)入激光束時(shí)，光線被阻擋，探測(cè)器記錄下光強(qiáng)度的下降。光強(qiáng)減少的值，當(dāng)然，與粒子的橫截面積成正比。在我們的自動(dòng)稀釋模塊中，如果超過一個(gè)粒子通過敏感區(qū)的概率高(這個(gè)概率與粒子濃度有關(guān))，樣品將自動(dòng)稀釋。分散液的粒子可被稀釋，并以一種可以在短時(shí)間間隔(500,000粒子/分鐘)內(nèi)計(jì)數(shù)的速度流入感應(yīng)區(qū)，而不會(huì)產(chǎn)生重合效應(yīng)。這意味著得到的顆粒大小分布是一個(gè)真實(shí)的顆粒大小分布，一次建立一個(gè)顆粒，具有很大的統(tǒng)計(jì)精度。不需要復(fù)雜的數(shù)學(xué)算法，只需要一條校準(zhǔn)曲線來轉(zhuǎn)換脈沖高度到直徑。由于自動(dòng)稀釋的能力，我們可以確定在一個(gè)時(shí)間只有一個(gè)粒子在檢測(cè)區(qū)域，所以所有進(jìn)入到檢測(cè)區(qū)域的粒子都是完整的計(jì)數(shù)，并且只計(jì)數(shù)一次。這樣的測(cè)量可以直接測(cè)定高分辨率顆粒粒徑分布(psd)，或者在psd主要低于一微米的情況下，可以觀察到粗顆粒尾部的復(fù)雜形狀。如前所述，780大小和計(jì)數(shù)粒子。這樣不僅可以得到粒度分布數(shù)據(jù)，而且可以得到定量計(jì)數(shù)信息。

本文采用帶有自動(dòng)稀釋裝置的AccuSzier 780進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，它被用來測(cè)試一種將全血分離成初始狀態(tài)的新儀器的效率。在大多數(shù)醫(yī)院，血細(xì)胞計(jì)數(shù)使用電阻法。電阻法采用一種電化學(xué)電池，由浸入鹽水中的兩個(gè)電極組成，并由一個(gè)帶有小孔的非導(dǎo)電玻璃屏障隔開，允許電荷從一個(gè)電極流向另一個(gè)電極。血液樣本會(huì)從細(xì)胞的一測(cè)注入。玻璃屏障上的壓力差會(huì)導(dǎo)致液體流過小孔。流動(dòng)的液體會(huì)帶著細(xì)胞穿過小孔。由于細(xì)胞是不導(dǎo)電的，一旦進(jìn)入小孔，它們就會(huì)減少電極間的電荷流動(dòng)，從而測(cè)量到相應(yīng)的電流減少(或維持電流所需的電壓增加)。這個(gè)響應(yīng)與單元的排除體積成比例。通過這種方式，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行粒徑大小檢測(cè)和計(jì)數(shù)。

在多年的使用中，電阻法存在著一些缺點(diǎn)。首先是需要一種高導(dǎo)電性的稀釋劑來懸浮粒子。這大大增加了操作成本。其次，小孔容易堵塞。后，由于孔徑如此之小，液體的流動(dòng)速度和計(jì)數(shù)顆粒的速度都有限制。所有這些問題都阻礙了將電阻法作為被測(cè)血液分離設(shè)備的附加模塊的使用。AccuSizer 780沒有受到上述問題的阻礙。由于該技術(shù)是基于光學(xué)的，任何合適的稀釋劑都可以使用。這對(duì)于血液分離裝置的使用很重要，因?yàn)樗枰煌木彌_溶液來實(shí)現(xiàn)不同程度的分離。其他離子的存在會(huì)對(duì)期望的分離產(chǎn)生不利影響。780中使用的流通池相對(duì)于紅細(xì)胞和白細(xì)胞(以及其他大的聚集物)的大小相當(dāng)大，所以阻塞很少。重要的是，大流量流通池將允許流速高達(dá)120 cc/min。這樣的流速使得樣品在分析前的自動(dòng)稀釋是可行的。

由于來自分離器的血液成分非常濃，因此需要稀釋才能準(zhǔn)確計(jì)算血細(xì)胞數(shù)量。為這個(gè)實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)的血細(xì)胞餾分從主要含有紅細(xì)胞到含有大量白細(xì)胞的餾分不等。6種不同百分比的血液檢測(cè)結(jié)果如圖線 4-9，圖線由ZETA電位檢測(cè)結(jié)果建立（AN 160文獻(xiàn)），其中百分比4號(hào)幾乎全是紅細(xì)胞。濃度5-9號(hào)分別含有的白細(xì)胞數(shù)量逐步上升。

圖1：不同細(xì)胞含量的對(duì)比圖

除分?jǐn)?shù)4外，每個(gè)分布由兩個(gè)窄峰組成。第一個(gè)紅細(xì)胞的平均直徑為8.5微米，與已知紅細(xì)胞大小相關(guān)。另一個(gè)峰的平均直徑為11-12微米。這個(gè)峰值與白細(xì)胞的已知值相匹配。所以把第一個(gè)峰(峰1)歸為紅細(xì)胞第二個(gè)峰(第2峰)歸為白細(xì)胞是有理有據(jù)的。注意，在圖1中，第二個(gè)峰值中的計(jì)數(shù)從分?jǐn)?shù)4中的幾乎為零增加到后面每個(gè)分?jǐn)?shù)中的越來越大的數(shù)量。首先，這表明分?jǐn)?shù)4實(shí)際上*是紅細(xì)胞。這一數(shù)據(jù)還表明，其他部分的白細(xì)胞變得更豐富。圖2包含了用幾種方法繪制白細(xì)胞和紅細(xì)胞比例的圖表。

圖2:a.白、紅細(xì)胞體積百分?jǐn)?shù)與血液百分?jǐn)?shù)比值;b.白、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)與血液百分?jǐn)?shù)的比值

圖2a是峰2粒子體積與峰1粒子體積之比，圖2b是峰2粒子數(shù)量與峰1粒子數(shù)量之比。這些計(jì)算證明，血液分離裝置能夠分離紅細(xì)胞和白細(xì)胞，并分離到何種程度。為了便于比較，值得一提的是，紅細(xì)胞與白細(xì)胞的正常比率約為500比1(數(shù)值比為0.002)。我們可以看到分?jǐn)?shù)5-9有更大的比率(分?jǐn)?shù)9的比率接近0.3，是比正常情況高出100)進(jìn)一步說明了分離裝置的效率。該數(shù)據(jù)還表明，780可以用于定量地測(cè)量一次測(cè)量中紅細(xì)胞和白細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。當(dāng)使用電阻法來計(jì)數(shù)白細(xì)胞時(shí)，必須先溶解(破壞)紅細(xì)胞，因?yàn)榧t細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量往往會(huì)使計(jì)數(shù)白細(xì)胞更加困難和不準(zhǔn)確。溶解作用同時(shí)影響紅細(xì)胞和白細(xì)胞:紅細(xì)胞幾乎全部被破壞，而白細(xì)胞的細(xì)胞膜被剝離，但傾向于結(jié)合在一起作為不同的顆粒。圖3包含測(cè)量前從裂解分?jǐn)?shù)6獲得的分布。裂解后，在約6-7微米處出現(xiàn)一個(gè)單峰。計(jì)數(shù)的數(shù)量大大減少。根據(jù)我們所知道的溶解化學(xué)物質(zhì)的影響，圖3中計(jì)數(shù)的顆粒是由于溶解而縮小的白細(xì)胞的殘留物。溶菌前峰值2的實(shí)際計(jì)數(shù)數(shù)與溶菌運(yùn)行時(shí)的計(jì)數(shù)數(shù)接近。

圖3:紅細(xì)胞溶解后分?jǐn)?shù)6的PSD

綜上所述，本文的數(shù)據(jù)說明SPOS可以同時(shí)計(jì)數(shù)紅細(xì)胞和白細(xì)胞。此外，它可以自動(dòng)檢測(cè)，AccuSizer 780可進(jìn)行自動(dòng)稀釋。紅和白細(xì)胞都可以通過這種方式定量分析，而不需要溶解紅細(xì)胞。研究人員確定，溶解確實(shí)*破壞了紅細(xì)胞，但它只是將白細(xì)胞的大小從12微米減小到6.5微米。

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