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*節(jié) 概 述

質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。如果要克隆 較小的DNA 片段（＜10kb）且結(jié)構(gòu)簡單,質(zhì)粒要比其它任何載體都要好。在質(zhì)粒載體上進(jìn)行克隆 ,從原理上說是很簡單的，先用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA 和目的DNA 片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌,即可完成。但在實(shí)際工作中, 如何區(qū)分插入有外源DNA 的重組質(zhì)粒和無插入而自身環(huán)化的載體分子是較為困難的。通過調(diào)整連接反應(yīng)中外源DNA 片段和載體DNA 的濃度比例,可以將載體的自身環(huán)化限制在一定程度之下,也可以進(jìn)一步采取一些特殊的克隆 策略,如載體去磷酸化等來zui大限度的降低載體的自身環(huán)化,還可以利用遺傳學(xué)手段如α互補(bǔ)現(xiàn)象等來鑒別重組子和非重組子。

外源DNA 片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種：

1、帶有非互補(bǔ)突出端的片段 用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)的粘性末端,這也是zui容易克隆 的DNA 片段，一般情況下,常用質(zhì)粒載體均帶有多個(gè)不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點(diǎn)，因而幾乎總能找到與外源DNA 片段末端匹配的限制酶切位點(diǎn)的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在PCR擴(kuò)增時(shí)，在DNA 片段兩端人為加上不同酶切位點(diǎn)以便與載體相連。

2、帶有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。 由于質(zhì)粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個(gè)相同粘性末端，因此在連接反應(yīng)中外源片段和質(zhì)粒載體DNA 均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個(gè)分子串連形成寡聚物, 而且正反兩種連接方向都可能有。所以，必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩種DNA 的濃度, 以便使正確的連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到zui高水平。還可將載體DNA 的5'磷酸基團(tuán)用堿性磷酸酯酶去掉, zui大限度地抑制質(zhì)粒DNA 的自身環(huán)化。帶5'端磷酸的外源DNA 片段可以有效地與去磷酸化的載體相連, 產(chǎn)生一個(gè)帶有兩個(gè)缺口的開環(huán)分子,在轉(zhuǎn)入E. coli受體菌后的擴(kuò)增過程中缺口可自動修復(fù)。

3、帶有平末端 是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA 聚合酶補(bǔ)平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應(yīng)中，T4 DNA 連接酶的濃度和外源DNA 及載體DNA 濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇（PEG 8000）以促進(jìn)DNA 分子凝聚成聚集體的物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化效率。

特殊情況下，外源DNA 分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配,則可以在線狀質(zhì)粒載體末端或外源DNA 片段末端接上合適的接頭（linker）或銜接頭（adapter）使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA 聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)末端或轉(zhuǎn)為平末端后再進(jìn)行連接。

本實(shí)驗(yàn)所使用的載體質(zhì)粒DNA 為pBS,轉(zhuǎn)化受體菌為E. coli DH5α菌株。由于pBS上帶有Ampr 和lacZ基因,故重組子的篩選采用Amp抗性篩選與α-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選相結(jié)合的方法。

因pBS帶有Ampr 基因而外源片段上不帶該基因,故轉(zhuǎn)化受體菌后只有帶有pBS DNA 的轉(zhuǎn)化子才能在含有Amp的LB平板上存活下來;而只帶有自身環(huán)化的外源片段的轉(zhuǎn)化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。

pBS上帶有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和β-半乳糖苷酶N端146個(gè)氨基酸的編碼序列。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn),但并沒有破壞lacZ的閱讀框架,不影響其正常功能。E. coli DH5α菌株帶有β-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨(dú)立的情況下,pBS和DH5α編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pBS和DH5α融為一體時(shí)可形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。這種lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酸陰性突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)的現(xiàn)象叫α-互補(bǔ)。由α-互補(bǔ)產(chǎn)生的Lac+ 細(xì)菌較易識別，它在生色底物X-gal（5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）下存在下被IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）誘導(dǎo)形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源片段插入到pBS質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上后會導(dǎo)致讀碼框架改變, 表達(dá)蛋白失活, 產(chǎn)生的氨基酸片段失去α-互補(bǔ)能力, 因此在同樣條件下含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。在麥康凱培養(yǎng)基上，α-互補(bǔ)產(chǎn)生的Lac+細(xì)菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麥康凱培養(yǎng)基中的乳糖，產(chǎn)生乳酸，使pH下降，因而產(chǎn)生紅色菌落，而當(dāng)外源片段插入后，失去α-互補(bǔ)能力，因而不產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，無法分解培養(yǎng)基中的乳糖，菌落呈白色。由此可將重組質(zhì)粒與自身環(huán)化的載體DNA 分開。此為α-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選。

第二節(jié) 材料、設(shè)備及試劑

一、 材料

外源DNA 片段: 自行制備的帶限制性末端的DNA 溶液,濃度已知; 載體DNA : pBS質(zhì)粒（Ampr ,lacZ）,自行提取純化,濃度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互補(bǔ)能力的菌株。

二、 設(shè)備

恒溫?fù)u床，臺式高速離心機(jī)，恒溫水浴鍋， 瓊脂糖凝膠電泳裝置， 電熱恒溫培養(yǎng)箱，電泳儀無菌，工作臺， 微量移液槍，eppendorf管。

三、 試劑

1、連接反應(yīng)緩沖液（10×）：0.5mol/L Tris?Cl （pH7.6），100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫蘇糖醇（DTT）（過濾滅菌），500μg/ml 牛血清清蛋白（組分V.Sigma 產(chǎn)品）（可用可不用），10mol/L ATP（過濾滅菌）。

2、T4 DNA 連接酶（T4 DNA ligase）；購買成品。

3、X-gal儲液（20mg/ml）: 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的儲液, 包以鋁箔或黑紙以防止受光照被破壞, 儲存于-20℃。

4、IPTG儲液（200mg/ml）: 在800μl蒸餾水中溶解200mg IPTG后,用蒸餾水定容至1ml,用0.22μm濾膜過濾除菌，分裝于eppendorf管并儲于-20℃。

5、麥康凱選擇性培養(yǎng)基（Maconkey Agar）：取52g麥康凱瓊脂加蒸餾水1000ml，微火煮沸至*浴解，高壓滅菌，待冷至60℃左右加入Amp儲存液使終濃度為50mg/ml，然后搖勻后涂板。

6、含X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基：在事先制備好的含50μg/ml Amp的LB平板表面加40ml X-gal儲液和4μlIPTG儲液,用無菌玻棒將溶液涂勻,置于37℃下放置3-4小時(shí),使培養(yǎng)基表面的液體*被吸收。

7、感受態(tài)細(xì)胞制備試劑: 見第三章。

8、煮沸法快速分離質(zhì)粒試劑: 見*章。

9、質(zhì)粒酶及電泳試劑: 見第二章。

第三節(jié) 操作步驟

一、 連接反應(yīng)

1、取新的經(jīng)滅菌處理的0.5ml eppendorf管, 編號。

2、將0.1μg載體DNA 轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，加等摩爾量（可稍多）的外源DNA 片段。

3、加蒸餾水至體積為8μl,于45℃保溫5分鐘,以使重新退火的粘端解鏈。將混和物冷卻至0℃。

4、加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混勻后用微量離心機(jī)將液體全部甩到管底,于16℃保溫8-24小時(shí)。

同時(shí)做二組對照反應(yīng)，其中對照組一只有質(zhì)粒載體無外源DNA ；對照組二只有外源DNA 片段沒有質(zhì)粒載體。

二、 E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化

每組連接反應(yīng)混和物各取2μl轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。具體方法見第三章。

三、 重組質(zhì)粒的篩選

1、每組連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化原液取100μl用無菌玻棒均勻涂布于篩選培養(yǎng)基上,37℃下培養(yǎng)半小時(shí)以上,直至液體被*吸收。

2、倒置平板于37℃繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時(shí),待出現(xiàn)明顯而又未相互重疊的單菌落時(shí)拿出平板。

3、放于4℃數(shù)小時(shí),使顯色*（此步麥康凱培養(yǎng)基不做）。

不帶有pBS質(zhì)粒DNA 的細(xì)胞,由于無Amp抗性,不能在含有Amp的篩選培養(yǎng)基上成活。帶有pBS載體的轉(zhuǎn)化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在麥康凱篩選培養(yǎng)基上呈現(xiàn)為紅色菌落。在X-gal和ITPG培養(yǎng)基上為藍(lán)色菌落。帶有重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子由于喪失了β-半乳糖苷酶活性,在麥康凱選擇性培養(yǎng)基和x-gal和ITPG培養(yǎng)基上均為白色菌落。

四、 酶切鑒定重組質(zhì)粒

用無菌牙簽挑取白色單菌落接種于含Amp 50μg/ml的 5ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。使用煮沸法快速分離質(zhì)粒DNA 直接電泳，同時(shí)以煮沸法抽提的pBS質(zhì)粒做對照，有插入片段的重組質(zhì)粒電泳時(shí)遷移率較pBS慢。再用與連接未端相對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)一步進(jìn)行酶切檢驗(yàn)。還可用雜交法篩選重組質(zhì)粒。

[注意] 1、DNA 連接酶用量與DNA 片段的性質(zhì)有關(guān)，連接平齊末端，必須加大酶量，一般使用連接粘性末端酶量的10-100倍。

2、在連接帶有粘性末端的DNA 片段時(shí)，DNA 濃度一般為2-10mg/ml，在連接平齊末端時(shí)，需加入DNA 濃度至100-200mg/ml。

3、連接反應(yīng)后，反應(yīng)液在0℃儲存數(shù)天，-80℃儲存2個(gè)月，但是在-20℃冰凍保存將會降低轉(zhuǎn)化效率。

4、粘性末端形成的氫鍵在低溫下更加穩(wěn)定，所以盡管T4 DNA 連接酶的zui適反應(yīng)溫度為37℃，在連接粘性末端時(shí)，反應(yīng)溫度以10-16℃為好，平齊末端則以15-20℃為好。

5、在連接反應(yīng)中，如不對載體分子進(jìn)行去5'磷酸基處理，便用過量的外源DNA 片段（2-5倍），這將有助于減少載體的自身環(huán)化，增加外源DNA 和載體連接的機(jī)會。

6、麥康凱選擇性瓊脂組成的平板，在含有適當(dāng)抗生素時(shí)，攜有載體DNA 的轉(zhuǎn)化子為淡紅色菌落，而攜有帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落。該產(chǎn)品篩選效果同藍(lán)白斑篩選，且價(jià)格低廉。但需及時(shí)挑取白色菌落，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長，白色菌落會逐漸變成微紅色，影響挑選。

7、X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside）以半乳糖苷酶（b-galactosidase）水解后生成的吲哚衍生物顯藍(lán)色。IPTG是異丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside），為非生理性的誘導(dǎo)物，它可以誘導(dǎo)lacZ的表達(dá)。

8、在含有X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上，攜帶載體DNA 的轉(zhuǎn)化子為藍(lán)色菌落，而攜帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落，平板如在37℃培養(yǎng)后放于冰箱3-4小時(shí)可使顯色反應(yīng)充分，藍(lán)色菌落明顯。