利用改進的CRISPR/Cas9技術(shù)直接改變細胞身份

在一項新的研究中，研究人員利用經(jīng)過基因修飾的CRISPR/Cas9---一種新的革命性的基因編輯技術(shù)---將從小鼠結(jié)締組織中分離出的成纖維細胞直接轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。

2006年，日本京都大學(xué)前沿醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所山中伸彌教授發(fā)現(xiàn)如何讓來自成年結(jié)締組織的成纖維細胞返回到未成熟的能夠分化為任何一種細胞類型的干細胞。這些所謂的誘導(dǎo)性多能干細胞（iPS細胞）因在研究和醫(yī)學(xué)中的巨大潛力僅在6年后就讓山中伸彌教授獲得諾貝爾獎。

從那之后，科學(xué)家們已發(fā)現(xiàn)其他的方法將一種類型的細胞轉(zhuǎn)化為其他類型的細胞。這主要是通過導(dǎo)入多種額外拷貝的“主開關(guān)”基因---表達激活特定細胞類型所需的整個基因網(wǎng)路的蛋白---來實現(xiàn)的。

如今，在這項新的研究中，來自美國杜克大學(xué)的研究人員開發(fā)出一種不再需要導(dǎo)入額外基因拷貝的策略。相反，他們利用一種經(jīng)過基因修飾的CRISPR/Cas9基因編程技術(shù)直接激活已經(jīng)存在于細胞基因組中的自然拷貝。相關(guān)研究結(jié)果于2016年8月11日在線發(fā)表在Cell Stem Cell期刊上，論文標題為“Targeted Epigenetic Remodeling of Endogenous Loci by CRISPR/Cas9-Based Transcriptional Activators Directly Converts Fibroblasts to Neuronal Cells”。

這些早期的研究結(jié)果表明相比于*性地將新的基因加入到宿主細胞基因組中的方法，利用這種經(jīng)過基因修飾的CRISPR/Cas9方法實現(xiàn)小鼠胚胎成纖維細胞直接變成神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化過程更加*和更加持久。

這些神經(jīng)元細胞可能能夠被用來構(gòu)建神經(jīng)疾病模型、發(fā)現(xiàn)新的治療方法和開發(fā)個人化療法，而且可能在未來開展細胞療法。

論文通信作者、杜克大學(xué)生物分子與組織工程中心主任和生物醫(yī)學(xué)工程副教授Charles Gersbach博士說，“這種技術(shù)在科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)上具有很多應(yīng)用。比如，我們可能對大多數(shù)人的神經(jīng)元如何對藥物作出反應(yīng)產(chǎn)生一種粗略的印象。獲取你大腦的活組織樣品來測試你的神經(jīng)元在倫理上是不允許的。但是如果我們能夠從你的手臂獲得皮膚細胞，將它轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元，然后利用多種藥物組合對它進行處理，我們就可能確定出一種*的個人化療法。”

論文*作者、Gersbach實驗室研究生Joshua Black說，“面臨的挑戰(zhàn)就是地產(chǎn)生穩(wěn)定的神經(jīng)元，而且它們看起來非常類似于你體內(nèi)真正的神經(jīng)元。這一直是這個領(lǐng)域的重大障礙。”

二十世紀五十年代，英國發(fā)育生物學(xué)家Conrad Waddington教授提出未成熟的干細胞分化為特定類型的成體細胞就好像是從一座有脊的山峰沿著側(cè)邊滾到眾多山谷中的一種。當(dāng)一種細胞沿著一種特定的斜坡選擇每種路徑后，它對*目的地的選擇會變得越來越少。

你想要改變這種目的地，一種方法就是將這種細胞垂直地推回到山頂上---這就是將細胞重編程為iPS細胞的想法。另一種選擇就是水平地讓這種細胞向上翻越一個小山峰，直接進入另一種山谷。

Gersbach說，“如果你能夠特特異性地激活所有的神經(jīng)元基因，那么就可能不一定需要向上翻越這個小山峰。”

之前的方法是通過導(dǎo)入攜帶額外基因拷貝---能夠在細胞內(nèi)產(chǎn)生大量被稱作主轉(zhuǎn)錄因子的蛋白---的病毒來做到這一點的。這些蛋白（依據(jù)不同的細胞類型，存在不同）結(jié)合到基因組上的上千個位點，激活靶細胞的特定基因網(wǎng)絡(luò)。然而，這種方法也存在一些缺點。

Black說，“不是通過病毒*性地導(dǎo)入現(xiàn)存基因的額外拷貝而是通過提供一種暫時的信號以一種穩(wěn)步的方式改變細胞類型將是可取的。然而，地做到這一點可能需要對細胞的基因程序作出非常特異性的改變。”

在這項新的研究中，Black、Gersbach和同事們利用經(jīng)過基因修飾的CRISPR/Cas9技術(shù)準確地激活三種基因Brn2、Ascl1和Myt1l來自然地產(chǎn)生這些控制神經(jīng)元基因網(wǎng)絡(luò)的主轉(zhuǎn)錄因子，而不是導(dǎo)入攜帶這些額外基因拷貝的病毒。

研究人員先將細菌防御系統(tǒng)CRISPR/Cas9進行基因修飾讓它與一種基因激活物偶聯(lián)在一起，這樣仍然能夠鑒定出特異性的DNA片段，但是不會切割靶片段，而是讓它們保持完整，同時利用基因激活物將靶片段激活。

在實驗室中，將這種經(jīng)過基因修飾的CRISPR/Cas9系統(tǒng)注射到小鼠胚胎成纖維細胞中。檢測結(jié)果表明一旦被這種系統(tǒng)激活，這三種神經(jīng)元主轉(zhuǎn)錄因子基因就強力地激活神經(jīng)元基因。這導(dǎo)致這些成纖維細胞傳導(dǎo)電信號---神經(jīng)元的一種典型特征。而且即便將與CRISPR/Cas9偶聯(lián)的基因激活物取走后，這些細胞仍然保持它們的神經(jīng)元性質(zhì)。

Gersbach說，“當(dāng)將攜帶表達這三種主轉(zhuǎn)錄因子的基因的病毒導(dǎo)入細胞中時，也可能讓這些細胞表現(xiàn)得像神經(jīng)元一樣。但是如果它們真地變成自主發(fā)揮功能的神經(jīng)元，那么它們就應(yīng)當(dāng)不需要這種外部的刺激持續(xù)存在。” 

這些實驗證實利用這種經(jīng)過基因修飾的CRISPR/Cas9技術(shù)產(chǎn)生的神經(jīng)元在靶基因上的表觀遺傳程序與在小鼠大腦組織中自然發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)元標志相匹配。

Black解釋道，“利用病毒引入額外基因拷貝的方法大量地產(chǎn)生這些轉(zhuǎn)錄因子，但是這些基因的自然拷貝非常少地產(chǎn)生這些蛋白。相比之下，這種經(jīng)過基因修飾的CRISPR/Cas9方法總體上并不產(chǎn)生如此多的轉(zhuǎn)錄因子，但是它們是由正常的染色質(zhì)位點產(chǎn)生的，這就是這些基因在穩(wěn)步激活后發(fā)生的顯著差別。我們啟動這種表觀遺傳開關(guān)來改變細胞類型，而不是通過合成方式迫使它們這樣做。”

根據(jù)Black的說法，接下來的行動方案就是將這種方法拓展到人類細胞中，提高這種技術(shù)的效率，并且試圖清除其他的表觀遺傳障礙，這樣它可能能夠用來構(gòu)建特定疾病模型。

Gersbach說，“在未來，你能夠想象在體外制造神經(jīng)元并將它們移植到大腦中來治療帕金森病或其他神經(jīng)退行性疾病。但是即便我們不能夠走到這一步，我們?nèi)匀荒軌蛟趯嶒炇抑欣眠@種方法大展手腳來協(xié)助開發(fā)更好的療法。