本文要點(diǎn)：各種方酸染料已被開發(fā)用于生物成像。然而，由于缺乏一種簡(jiǎn)單、通用的設(shè)計(jì)策略，在第二窗口(近紅外Ⅱ 1000?1700 nm)發(fā)射的方酸染料的研究報(bào)道很少，在這篇文章中，探索了分子工程策略來開發(fā)具有NIR-II發(fā)射的方酸染料。首先，以1，8-萘內(nèi)酰亞胺為給體，方酸為受體合成了NIR-I染料SQ2,引入丙二腈作為強(qiáng)吸電子基團(tuán)使熒光發(fā)射紅移到NIR-II窗口，合成了SQ1。為了將NIR-II型熒光載體SQ1轉(zhuǎn)化為有效的治療藥物，構(gòu)建了以纖維連接蛋白為靶點(diǎn)的SQ1納米探針，在血管造影和腫瘤成像(包括深部組織中的肺轉(zhuǎn)移灶)中顯示出優(yōu)異的NIR-II成像性能。此外，SQ1納米探針可用于腫瘤的光聲成像和光熱消融。本研究表明，采用供體?受體工程策略開發(fā)近紅外-Ⅱ類方酸染料是可行和有效的。

方酸染料SQ1用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的NIR-II/PA雙峰成像和光熱消融的分子工程和納米功能化研究方案1.

首先，SQ1納米探針的構(gòu)建與表征如圖1，具有受體工程的SQ1在930和970 nm處表現(xiàn)出明顯的紅移(圖1b，c)。因此，SQ1的熒光發(fā)射延伸到了近紅外-Ⅱ區(qū)，表明D?A?D工程成功地使SQ1成為近紅外-Ⅱ發(fā)射體。

圖1：(A)SQ1和SQ2有機(jī)合成示意圖，(B)四氫呋喃(THF)中SQ1和SQ2的吸光度和發(fā)射率，(d，e)密度泛函理論(DFT)計(jì)算(D)SQ1和(E)SQ2的HOMO和LUMO

為了將近紅外熒光團(tuán)SQ1轉(zhuǎn)化為有效的熱敏劑，在超聲作用下，將溶解的SQ1與DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-MAL一起在水中納米沉淀，制備SQ1@DSPE，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)的活性靶向纖維連接蛋白的多肽CREKA通過半胱氨酸(Cys)與SQ1@DSPE的反應(yīng)被共價(jià)連接到SQ1@DSPE上就獲得SQ1納米探針。

圖2：SQ1納米探針的尺寸分析和光物理特性 (A)SQ1納米探針的DLS和TEM。(B)Sq1納米探針在PbS中的吸收光譜和熒光光譜，(c，d)近紅外-II型熒光圖像和(E)偽彩色圖像和(F)SQ1納米探針和SQ2納米探針，在915 nm光照下的定量曲線，(g，h)含有SQ1、SQ2納米探針(1 mg/mL)試管在近紅外激光(915 nm，100 mW/cm2)照射下，(G)在沒有和(H)覆蓋豬肉組織的情況下進(jìn)行NIR-II成像

如圖2a所示，透射電子顯微鏡(TEM)和動(dòng)態(tài)激光光散射(DLS)顯示SQ1納米探針的長(zhǎng)度分別約為20 nm和42 nm。與SQ1相比，SQ1納米探針的吸收峰在930 nm處略有紅移至940 nm(圖2b)。與SQ1(0.13%)相比，與DSPE-PEG2000結(jié)合形成納米粒子后，SQ1納米探針的量子產(chǎn)率提高到1.7%。SQ1納米探針在940 nm處的強(qiáng)吸收也顯示了PA成像的潛力。SQ1納米探針在980 nm處顯示熒光峰延伸到NIR-II區(qū)域。SQ1型納米探針的熒光信號(hào)與納米探針濃度呈良好的線性相關(guān)(圖2c?f)。此外，在含有SQ1和SQ2納米探針(1 mg/mL)的試管上覆蓋豬肉切片，檢測(cè)組織滲透深度如圖2g，h所示，SQ1納米探針在915 nm(100 mW/cm2)的照射下，其明亮的NIR-II發(fā)射可以穿透覆蓋的豬肉切片(3 mm)。值得注意的是，DSPE-PEG2000的包裹和腫瘤靶向多肽的修飾幾乎沒有改變SQ1的光學(xué)性質(zhì)，表明制備良好的SQ1納米探針適合于NIR-II成像。

圖3：(A)SQ1納米探針和SQ2納米探針的功率譜,(B)SQ1納米探針和SQ2納米探針在930 nm處的PA強(qiáng)度隨濃度的變化曲線,(C)SQ1納米探針和SQ2納米探針(0.0625、0.125、0.250.5、1.0mg/mL)在930nm處的PA圖像(D)SQ1、Q2納米探針(1 mg/mL)的光熱加熱圖像和(E)SQ1納米探針(0.125，0.25，0.5，1.0 mg/mL)在近紅外激光照射下的溫度曲線

接著，還研究了不同濃度的SQ1納米探針的PA強(qiáng)度和圖像。如圖3a所示，SQ1納米探針的PA光譜在930 nm處出現(xiàn)一個(gè)峰值，這與吸收相一致。根據(jù)圖3b，c中不同濃度的SQ1納米探針的PA圖像，PA信號(hào)與SQ1納米探針的濃度(0.0625?1 mg/mL)呈線性正相關(guān)。因此，將NIR-II成像與PA成像相結(jié)合作為雙峰成像可以提高乳腺癌的成像準(zhǔn)確性。受近紅外區(qū)高吸收強(qiáng)度的啟發(fā)，進(jìn)一步研究了SQ1納米探針的光熱性質(zhì)。如圖3D所示，含有SQ1納米探針的試管溫度從29.3°C上升到70.5°C，而單獨(dú)含有PbS的試管在激光照射下溫度變化不大，SQ2納米探針的溫度略有升高，Q1納米探針的光熱轉(zhuǎn)換效率為25.6%。此外，圖3E中的SQ1納米探針在915 nm激光(0.5W/cm2)照射下表現(xiàn)出濃度依賴性的溫度變化，這表明SQ1納米探針可以用于腫瘤的光熱消融。

圖4：(a，b)乳腺癌細(xì)胞蛋白免疫印跡，(C)冰凍切片檢測(cè)細(xì)胞核(Dapi)和纖維連接蛋白(Alexa Fluor488標(biāo)記的抗纖維連接蛋白抗體)(比例尺，50μm)，(D)SQ1納米探針SQ1NP+L處理的乳腺癌細(xì)胞存活率(e，f)用0.5 mg/mLSQ1納米探針(E)在黑暗中或(F)用0.5W/cm2的915 nm激光照射5min，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鈣調(diào)素-AM/碘化丙啶(PI)染色，比例尺：100μm

接下來，為了研究纖連蛋白水平與乳腺癌腫瘤惡性程度之間的依賴性，通過高度惡性MDA-MB-231和低度惡性MCF-7細(xì)胞的western印跡測(cè)試?yán)w連蛋白。如圖4a，b所示，纖維連接蛋白的表達(dá)與乳腺癌的惡性程度呈正相關(guān)。因此，通過纖維連接蛋白結(jié)合肽的修飾，SQ1納米探針可以用來靶向纖維連接蛋白，并根據(jù)乳腺癌腫瘤中纖維連接蛋白水平的差異來識(shí)別高危乳腺癌。

為了生物相容性的考慮，用CCK8檢測(cè)與SQ1納米探針孵育的MDA-MB231細(xì)胞的存活率。SQ1納米探針顯示出較低的細(xì)胞毒性，在與SQ1納米探針(0?512μg/mL)孵育24小時(shí)后，80%以上的細(xì)胞仍然存活(圖4d)。因此，SQ1納米探針是一種生物相容性顯像劑。最終，超過80%的MDA-MB-231細(xì)胞被SQ1納米探針介導(dǎo)的光熱效應(yīng)殺死。SQ1納米探針(0.5 mg/mL)和近紅外激光(0.5W/cm2)預(yù)處理的MDA-MB-231細(xì)胞幾乎全部顯示SQ1納米探針能有效地在體外光熱殺滅腫瘤細(xì)胞。

圖5：SQ1納米探針的體內(nèi)成像特性，(A)靜脈注射SQ1納米探針10分鐘后，對(duì)小鼠血管進(jìn)行近紅外成像(NIR-II)，(b，c)兩個(gè)區(qū)(ROI 1和ROI 2)放大的后肢NIR-II圖像，(d，e)ROI1和ROI2后肢紅線的熒光強(qiáng)度，(F)靜脈注射SQ1納米探針或SQ1@DSPE(對(duì)照)后0、1、2、6、12和24小時(shí)，對(duì)陽性的MDA-MB-231腫瘤進(jìn)行NIR-II顯像，(G)在NIR-II顯像后同時(shí)進(jìn)行腫瘤PA顯像，比例尺是2mm

緊接著，為了顯示近紅外-II成像在血管造影中的優(yōu)點(diǎn)，靜脈注射SQ1100?納米探針(100μL，100μg)后，用近紅外-II成像技術(shù)在1000mm1100 nm區(qū)域?qū)π∈笱苓M(jìn)行成像。NIR-II成像可以清楚地顯示第二個(gè)窗口中由于組織穿透增加而導(dǎo)致的皮膚下血管的分布(圖5a)。高倍率的NIR-II圖像可以清楚地顯示通過小鼠后肢動(dòng)脈的血液流動(dòng)(圖5b，c)。提示NIR-II成像適用于血管造影(圖5d，e)。這些結(jié)果表明，使用SQ1納米探針進(jìn)行血管造影的NIR-II成像是可行的。

然后為了研究SQ1納米探針在小鼠體內(nèi)的近紅外成像能力，分別對(duì)SQ1納米探針(100μL，100μg)和非靶向SQ1@DSPE(100μL，100μg)進(jìn)行了研究。如圖5f所示，對(duì)于注射SQ1納米探針的小鼠，腫瘤內(nèi)的NIR-II成像信號(hào)顯著增強(qiáng)，注射SQ1@DSPE的小鼠腫瘤區(qū)域的熒光增強(qiáng)要弱得多。

如NIR-II和PA成像所示，SQ1納米探針可以很好地累積到MDA-MB-231腫瘤中，這主要是由于SQ1納米探針的有效主動(dòng)靶向，而SQ1@DSPE通過被動(dòng)靶向攝入腫瘤。這些結(jié)果表明SQ1納米探針具有顯著的腫瘤靶向成像能力。NIR-II/PA雙峰成像顯示靶向肽修飾的SQ1納米探針可以特異性結(jié)合纖連蛋白陽性乳腺癌腫瘤。這清楚地表明SQ1納米探針可以準(zhǔn)確地檢測(cè)和表達(dá)纖維連接蛋白陽性乳腺癌的腫瘤病變。

圖6：使用SQ1納米探針對(duì)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移小鼠的NIR-II成像，(a，b)靜脈注射SQ1納米探針后12h，(A)荷肺轉(zhuǎn)移瘤小鼠和(B)正常小鼠的NIR-II顯像，(C)肺轉(zhuǎn)移小鼠和(D)正常小鼠全身NIR-II成像后的器官的體外NIR-II成像，(E)肺轉(zhuǎn)移小鼠和(F)正常小鼠肺切片經(jīng)NIR-II成像后進(jìn)行(e，f)H&E組織化學(xué)分析，比例尺為200μm

為了進(jìn)一步評(píng)估SQ1納米探針定位乳腺癌轉(zhuǎn)移性肺部病變的能力。與正常小鼠相比，攜帶肺轉(zhuǎn)移的小鼠的肺顯示增強(qiáng)的NIR-II熒光信號(hào)，表明SQ1納米探針可以選擇性地靶向乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移病灶（圖6a，b）且發(fā)現(xiàn)患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌的小鼠的肺確實(shí)顯示出增加的信號(hào)，表明SQ1納米探針在肺轉(zhuǎn)移模型中的腫瘤特異性靶向能力（圖6c，d）。如圖6e，f所示，攜帶轉(zhuǎn)移性腫瘤的小鼠肺中的多個(gè)病變顯示肺切片中存在浸潤(rùn)性腫瘤細(xì)胞，這進(jìn)一步證實(shí)SQ1納米探針能夠通過深度穿透來解決乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。

圖7：使用SQ1納米探針(SQ1NP)對(duì)小鼠乳腺癌腫瘤進(jìn)行熱成像和PTT，(A)注射PBS或SQ1NP加激光治療后腫瘤的熱成像。(B)光熱治療過程中腫瘤的溫度變化，(C)腫瘤生長(zhǎng)曲線；(D)治療期間小鼠生長(zhǎng)曲線，(E)PBS、PBS+L、SQ1NP、SQ1NP+L治療后解剖腫瘤重量，標(biāo)尺為50μm。

最后，SQ1納米探針具有良好的腫瘤靶向性和良好的體外治療效果，進(jìn)一步促進(jìn)了對(duì)乳腺癌光熱治療的體內(nèi)評(píng)價(jià)。如圖7a，b所示，注射SQ1納米探針的小鼠的腫瘤溫度從33.2°C迅速上升到59.1°C，而PBS預(yù)處理的腫瘤溫度沒有明顯變化。這些結(jié)果證實(shí)了SQ1納米探針在近紅外輻射下確實(shí)能誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生顯著的熱變化。為驗(yàn)證其光熱治療效果，對(duì)MDAMB-231乳腺癌荷瘤小鼠分別治療，如圖7c所示，隨著時(shí)間的推移，腫瘤體積的這些差異變得更加明顯。此外，小鼠的體重變化與H&E組織化學(xué)分析顯示SQ1納米探針在近紅外激光照射下對(duì)乳腺癌腫瘤有明顯的光熱損傷作用，具有較高的光熱治療效率。

結(jié)論：通過合理的D-A-D工程，合成了一種發(fā)射延伸至第二窗口的方堿染料。方酸染料SQ1通過簡(jiǎn)單的納米沉淀和靶向多肽修飾可以被包裹成SQ1納米探針，顯示出NIR-II/PA雙峰成像能力和良好的光熱效應(yīng)。小鼠的NIR-II顯像表明，SQ1納米探針適合于血管造影和腫瘤靶向顯像，尤其是肺轉(zhuǎn)移灶。此外，SQ1納米探針利用在近紅外輻射下優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換能力，在實(shí)體腫瘤的PA成像和PTT中都表現(xiàn)良好?？紤]到它在NIR-II區(qū)域的治療學(xué)的固有優(yōu)勢(shì)，基于方酸的治療納米探針將啟發(fā)其他轉(zhuǎn)移性乳腺癌的創(chuàng)新設(shè)計(jì)。

參考文獻(xiàn)

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近紅外二區(qū)小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system 

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機(jī)，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優(yōu)于3um

熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us

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多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴(kuò)展X射線輻照、熒光壽命、一區(qū)熒光成像、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 近紅外二區(qū)高分辨顯微系統(tǒng)，兼容成像型光譜儀

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 恒光智影

          上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司，專注于近紅外二區(qū)成像技術(shù)。致力于為生物醫(yī)學(xué)、臨床前和臨床應(yīng)用等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供*的、一體化的成像解決方案。自主研發(fā)近紅外二區(qū)小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)-MARS。

          與基于可見光波長(zhǎng)的傳統(tǒng)成像技術(shù)相比，我們的技術(shù)側(cè)重于X射線、紫外、紅外、短波紅外、太赫茲范圍，可為腫瘤學(xué)、神經(jīng)學(xué)、心血管、藥代動(dòng)力學(xué)等一系列學(xué)科的科研人員提供清晰的成像效果，助力科技研發(fā)。

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