本文要點：細菌感染嚴重危害人類生命與健康，在感染早期及時診斷并治療可以減輕患者痛苦甚至挽救生命，現(xiàn)有的技術手段可以檢測區(qū)分細菌種類，但耗時過長，浪費了寶貴的治療時間。因此作者合成了一種適用于診斷體內細菌感染的熒光探針DCNPs。該探針在近紅外二區(qū)窗口下，擁有高熒光強度和深穿透性。同時，作者將該探針與萬古霉素共價結合后（DCNPs-Van），探針能夠與革蘭氏陽性細菌特異性結合。在體外實驗和體內實驗驗證中，萬古霉素修飾后的探針可以對革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌加以區(qū)分，實現(xiàn)體內細菌感染的早期快速診斷。

納米探針DCNPs-Van合成示意圖及體內細菌感染的光聲成像示意圖（圖 1）。

圖 1：(a) 探針DCNPs-Van的合成路線。(b)基于DCNPs-Van的體內革蘭氏陽性細菌靶向成像示意圖。

首先，DCNPs的親水側暴露出的羧基（-COOH）可以和萬古霉素的氨基（-NH2）共價結合，變成可以靶向細菌的納米探針（DCNPs-Van）。電鏡下觀察兩種納米粒子，OA-DCNPs和DCNPs-Van均呈單分散，且DCNPs-Van的形態(tài)和粒徑與OA-DCNPs相比差異較小，表明其結晶性良好（圖 2）。

圖2：(a) OA-DCNPs和(c) DCNPs-Van的TEM圖像。(b) OA-DCNPs和(d) DCNPs-Van粒徑分布圖像。

對納米探針測定其發(fā)射曲線，發(fā)現(xiàn)NaGdF4:5 %Nd NPs在1060 nm 和1330 nm處均有發(fā)射帶（圖 3a）。同時因為減少了納米粒子表面的淬滅劑，NaGdF4:Nd@NaGdF4核殼型NPs下轉換發(fā)射強度強于NaGdF4:5 %Nd NPs。接下來，作者探究了Nd 3+離子濃度對NaGdF4:Nd@NaGdF4核殼型NPs下轉換熒光強度與晶體結構的影響。當增加Nd 3+離子到10 %時，依然沒有改變其發(fā)光強度（圖 3b）。此外，NaGdF4:5 %Nd NPs也表現(xiàn)出了很高的量子產率，接近28.5 %（圖 3c），這一數(shù)值超過了大部分鑭系的商用染料。

圖3: (a) NaGdF4:5 % ND和NaGdF4:5 %Nd@NaGdF4NPs的發(fā)射光譜。(b) NaGdF4:xNd@NaGdF4 NPs (x = 1,3,5,8，或10%)發(fā)射光譜。(c)在808 nm激光激發(fā)下，OA-DCNPs在環(huán)己烷中和DCNPs-Van在水中的發(fā)射光譜。(d) Van、PAA-DCNPs和DCNPs-Van的紫外-可見吸收光譜。

接下來，作者便將DCNPs-Van與革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球菌共孵育，在電鏡下可以觀測，探針逐漸與細菌表面結合（圖 4a-d）。為了驗證探針的特異性，作者選擇革蘭氏陰性細菌大腸桿菌作為對照，分別將不同濃度的大腸桿菌與金黃色葡萄球菌共孵育，對沉淀和上清液進行NIR-II光聲成像（圖4e-j）。隨著金黃色葡萄球菌濃度增高，沉淀的熒光信號加強，而上清液中熒光信號逐漸減弱。而在大腸桿菌光聲成像中，沉淀的熒光強度和上清液的熒光強度都不會隨著細菌濃度的改變而改變。證明DCNPs-Van可以與革蘭氏陽性細菌特異性結合。

圖4：(a, b)金黃色葡萄球菌和(c, d) DCNPs-Van標記后金黃色葡萄球菌的SEM圖像;(e)金黃色葡萄球菌懸液和(h)大腸桿菌懸液在808 nm激發(fā)(300 mW/cm2)下的NIR-II光聲圖像;(f)金黃色葡萄球菌懸浮液、(g)金黃色葡萄球菌上清液、(i)大腸桿菌懸浮液和(j)不同細菌濃度下的大腸桿菌上清液熒光強度變化曲線圖。

接下來，作者又探究了DCNPs-Van在體內NIR-II光聲成像的效果。首先作者將PAA-DCNPs分別注射到感染金黃色葡萄球菌與大腸桿菌的小鼠體內，在感染部位均未觀察到熒光信號（圖5 a，b）。然后，作者又將DCNPs-Van注射到兩種小鼠體內，在金黃色葡萄球菌感染小鼠體內，注射探針6 h后，感染部位出現(xiàn)明顯的熒光信號，直至24 h。而大腸桿菌感染小鼠未見熒光信號（圖5 c-e）。

圖5：在808 nm激光激發(fā)下，不同模型小鼠的NIR-II光聲圖像（300 mW / cm2）。（a）PAA-DCNPs注射到金黃色葡萄球菌感染小鼠體內。（b）PAA-DCNPs注射到大腸桿菌感染小鼠體內。（c）DCNPs-Van注射到金黃色葡萄球菌感染小鼠體內。（d）DCNPs-Van注射到大腸桿菌感染小鼠體內。

作者又探究了探針在體內的生物相容性。通過MTT測試，當DCNPs-Van濃度達到1000μg/ mL時，共孵育的NIH / 3 T3細胞（鼠胚胎細胞）活性在80 %，表明其具有良好的體外生物相容性（圖6 a）。將DCNPs-Van注射到健康小鼠體內，熒光信號主要集中在肝臟中，且在注射后第九天，熒光信號消失，表明探針可以經(jīng)過肝臟代謝（圖6 b）。對小鼠進行組織切片觀察，各器官與對照組小鼠相比無異常變化（圖6 c）。

圖6:（a）用不同濃度DCNPs-Van處理小鼠NIH/3T3細胞得到的細胞相對活性結果。（b）在注射探針后第3天和第9天，小鼠器官的NIR-II光聲圖像。（c）在注射探針后第3天和第9天，小鼠器官的H＆E染色圖像。

結論：作者開發(fā)了一個具有高量子產率的NIR-II納米探針，同時將其與萬古霉素共價結合。新的探針保留了原有探針的穩(wěn)定性，安全性與熒光特征，并可以在體內外和革蘭氏陽性細菌特異性結合。這可以用于開發(fā)體內細菌感染的早期診斷試劑，為實驗室和臨床診斷細菌感染提供便捷。

參考文獻

Leilei Sun, Sisi Shi, Hongchao Geng, YaoHuang, Yan Qiao, Jie Song, Lan Yang, Craig A. Grimes, Xinxin Feng, and Qingyun Cai.NaGdF4:Nd@NaGdF4 Core-ShellDown-Conversion Nanoparticles as NIR-II Fluorescent Probes for Targeted Imagingof Bacteria.ACS Applied Nano Materials 2021 4 (10), 11231-11238.

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