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【原理】瓊脂糖(agarose)是經(jīng)過挑選,以質(zhì)地較純的瓊脂(agar)作為原料而制成的。瓊脂在化學(xué)上是由瓊脂糖和瓊脂膠組成的復(fù)合物。瓊脂膠是一含有硫酸根和羥基的多糖,它具有離子交換性質(zhì),這種性質(zhì)會給電泳及凝膠過濾以不良的影響。瓊脂糖是直鏈多糖,它由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖的殘基交替排列組成。瓊脂糖主要通過氫鍵而形成凝膠。電泳時因凝膠含水量大(98-99%),近似自由電泳,因為固體支持物的影響少,故電泳速度快,區(qū)帶整齊。而且由于瓊脂糖不含帶電荷的基團,電滲影響很少,是一種較好的電泳材
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實驗原理血紅蛋白具有類過氧化物酶活性,可催化H2O2釋放新生態(tài)氧,使鄰甲聯(lián)苯胺氧化發(fā)生顏色變化,由無色zui終變?yōu)樗{紫色。根據(jù)顯色深淺與標準進行比較,可測出其含量。實驗方法材料:1.2g/L鄰甲聯(lián)苯胺溶液2.1%H2O23.10%醋酸溶液4.分光光度計方法:1.抽取靜脈血2-3ml,枸櫞酸鈉抗凝,離心分離血漿。2.按下表進行操作,用分光光度計,波長為530nm,以空白管調(diào)零,測定測定管的吸光度。試劑(ml)測定管空白管2g/L鄰甲聯(lián)苯胺溶液0.50.5患者血漿0.02/1%H2O20.50.5混
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蛋白質(zhì)技術(shù)專題:血紅蛋白電泳(hemoglobin electrophoresis)
實驗原理血紅蛋白電泳(hemoglobinelectrophoresis)目的是檢出和確認各種正常和異常的血紅蛋白。根據(jù)不同的血紅蛋白帶有不同的電荷,等電點不同,在一定的pH緩沖液中,血紅蛋白的等電點小于緩沖液的pH時帶負電荷,電泳時在電場中向陽極泳動,反之,Hb帶正電荷向陰極泳動。在一定電壓下,經(jīng)過一定時間的電泳,不同的血紅蛋白所帶電荷不同,分子量不同,其泳動方向和速度不同,可分離出各自的區(qū)帶,同時對電泳出的各區(qū)帶進行比色或電泳掃描,可進行各種血紅蛋白的定量分析。一般zui常用的是pH8.6醋 -
蛋白質(zhì)技術(shù)專題:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測外源蛋白的表達
[實驗原理]SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)是蛋白分析中zui經(jīng)常使用的一種方法。它是將蛋白樣品同離子型去垢劑十二烷基硫酸鈉(SDS)以及巰基乙醇一起加熱,使蛋白變性,多肽鏈內(nèi)部的和肽鏈之間的二硫鍵被還原,肽鏈被打開。打開的肽鏈靠疏水作用與SDS結(jié)合而帶負電荷,電泳時在電場作用下,肽鏈在凝膠中向正極遷移。不同的大小的肽鏈由于在遷移時受到的阻力不同,在遷移過程中逐漸分開,其相對遷移率與分子量的對數(shù)間成線形關(guān)系。pGLO是將綠色熒光蛋白(GFP)的基因克隆在阿拉伯糖啟動子之后的一種表達 -
蛋白質(zhì)技術(shù)專題:聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定IgG純度
(一)原理由于聚丙烯酰胺凝膠的濃度可以按要求配制,因此可以形成“連續(xù)系統(tǒng)”和“不連續(xù)系統(tǒng)”兩種電泳系統(tǒng)?!安贿B續(xù)系統(tǒng)”zui大的特點在于大大提高了樣品分離的分辨率。這種電泳的主要特點是:(1)使用兩種不同濃度的凝膠系統(tǒng);(2)配制兩種凝膠的緩沖溶液成分及pH不同,并且與電泳槽中電泳緩沖液的成分、pH也不相同。在實驗中,電泳凝膠分為兩層:上層膠為低濃度的大孔膠,稱為濃縮膠或成層膠,配制此層膠的緩沖液是Tris-HCl,pH6.7;下層膠則是高濃度的小孔膠,稱為分離膠或電泳膠,成膠的緩沖液是Tris -
蛋白質(zhì)在細菌中表現(xiàn)后,以反復(fù)的冷凍-解凍方法打破細胞,再用硫酸銨把蛋白質(zhì)沉淀下來,此步驟可以去除大部份核酸、多醣、脂質(zhì)等雜物。儀器用具:恒溫震蕩培養(yǎng)箱37℃;高速冷凍離心機及離心管(使用20,000rpm離心陀)使用高速離心機要注意:離心機及離心陀的溫度要預(yù)冷*,相對位置的兩只離心管要平衡好,離心陀轉(zhuǎn)速不能超過zui高速限;液態(tài)氮及冰筒;37℃溫水浴藥品試劑:轉(zhuǎn)型菌株pQG11/M15[pREP]單一菌落;LB/amp/kan及IPTG(1Mstock);Lysisbuffer(50mMNa3P
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蛋白質(zhì)技術(shù)專題:folin—酚試劑法(lowry法)測蛋白質(zhì)含量
一、實驗原理這種蛋白質(zhì)測定法是zui靈敏的方法之一。過去此法是應(yīng)用zui廣泛的一種方法,由于其試劑乙的配制較為困難(現(xiàn)在已可以訂購),近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的,只是加入了第二種試劑,即folin—酚試劑,以增加顯色量,從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是:在堿性條件下,蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產(chǎn)生深蘭色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下, -
一、原理1.葡聚糖凝膠SephadexG-200凝膠柱層析利用大分子不能進入凝膠顆粒內(nèi)部zui先流出柱外,而小分子物質(zhì)進入凝膠顆粒內(nèi)部,流速慢而zui后流出柱外,凝膠層析法能將不同分子大小的物質(zhì)分離開。(G-200能分離800-80000D分子量的蛋白質(zhì))2.利用離子交換法,選取DEAE-陰離子纖維素DE52柱材料,因為PPO是帶有陽離子的蛋白質(zhì),在層析時會吸附在柱材料上,而雜蛋白會洗下。后用NaCl梯度洗脫PPO,(NaCl為強離子交換劑,能將弱吸附在柱材料上的PPO置換下來)。粗酶液從而得到