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蛋白質(zhì)技術(shù)專題：蛋白質(zhì)凝膠電泳凝膠的制備
【材料與試劑】（1）30%的丙烯酰胺：分別稱取29g丙烯酰胺，1gN,N-亞甲雙丙烯酰胺加溫?zé)岬娜ルx子水60ml，加熱至37℃溶解，補(bǔ)加水至終體積為100ml,過(guò)濾，即配成30%（w/v）丙烯酰胺貯存溶液。丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在貯存過(guò)程中緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)楸┧岷碗p丙烯酸，這一脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化，故溶液的pH值不超過(guò)7.0，應(yīng)置于棕色瓶中4℃保存。（2）10%十二烷基硫酸鈉（SDS）：稱取10gSDS加去離子水90ml加熱至68℃，加幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH7.2加水至100ml，即為10%（w/v -
水化上樣（被動(dòng)上樣）1.從冰箱中取出IPG膠條，室溫放置10min。2.沿水化盤槽的邊緣從左向右線性加入樣品，槽兩端各1cm左右不加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產(chǎn)生氣泡，否則會(huì)影響膠條中蛋白質(zhì)的分布。3.用鑷子輕輕撕去IPG膠條上的保護(hù)層。注意：堿性端較脆弱，應(yīng)小心操作。4.將IPG膠條膠面朝下輕輕置于水化盤中樣品溶液上。注意：不要將樣品溶液弄到膠條背面，因?yàn)檫@些溶液不會(huì)被膠條吸收；還使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如產(chǎn)生了氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動(dòng)膠條，直到氣泡被趕走。5.
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蛋白質(zhì)技術(shù)專題：免疫共沉淀（Co-IP）詳細(xì)步驟教程
一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。目前多用精制的proreinA預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的pror -
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：蛋白質(zhì)的表達(dá)、分離和純化
目的要求（1）了解克隆基因表達(dá)的方法和意義。（2）了解重組蛋白親和層析分離純化的方法。實(shí)驗(yàn)原理克隆基因在細(xì)胞中表達(dá)對(duì)理論研究和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用都具有重要的意義。通過(guò)表達(dá)能探索和研究基因的功能以及基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理，同時(shí)克隆基因表達(dá)出所編碼的蛋白質(zhì)可供作結(jié)構(gòu)與功能的研究。大腸桿菌是目前應(yīng)用zui廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過(guò)細(xì)菌總蛋白量的80%。本實(shí)驗(yàn)中，攜帶有目標(biāo)蛋白基因的質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中，在37℃，IPTG誘導(dǎo)下，超量表達(dá)攜帶有 -
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot ）
標(biāo)簽：western-blot免疫印跡蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）可以：（1）從蛋白質(zhì)混合物中檢出目標(biāo)蛋白質(zhì)；（2）定量或定性確定細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)情況；（3）用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA相互作用后續(xù)分析。實(shí)驗(yàn)方法底物化學(xué)發(fā)光ECL法Western印跡法圖解實(shí)驗(yàn)方法原理Western免疫印跡（WesternBlot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過(guò)融合部分的抗體 -
PCR技術(shù)專題：差示反轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)
標(biāo)簽：差示反轉(zhuǎn)錄PCR差示反轉(zhuǎn)錄PCR也稱為mRNA差異顯示技術(shù)，它是將mRNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù)與PCR技術(shù)二者相互結(jié)合發(fā)展起來(lái)的一種RNA指紋圖譜技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、靈敏、RNA用量少、效率高、可同時(shí)檢測(cè)兩種或兩種以上經(jīng)不同處理或處于不同發(fā)育階段的樣品，該方法自問(wèn)世以來(lái)已被廣泛用于差異表達(dá)基因的克隆鑒定研究中。實(shí)驗(yàn)方法mRNA差異顯示法熒光標(biāo)記法實(shí)驗(yàn)方法原理幾乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都帶有一個(gè)多聚的腺苷酸結(jié)構(gòu)，即通常所說(shuō)的poly（A）尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA為 -
PCR技術(shù)專題：PCR-SSP分析實(shí)驗(yàn)原理和步驟
[實(shí)驗(yàn)原理]根據(jù)決定某等位基因的堿基性質(zhì)，設(shè)計(jì)3′端*個(gè)堿基分別與各等位基因的特異性堿基相匹配的序列特異性引物，在PCR反應(yīng)過(guò)程中，只有引物3′端*個(gè)堿基與決定特定等位基因的堿基互補(bǔ)時(shí)才能實(shí)現(xiàn)DNA片段的*復(fù)制，根據(jù)PCR產(chǎn)物的有無(wú)進(jìn)行等位基因的分型。[實(shí)驗(yàn)器材]PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽。[實(shí)驗(yàn)試劑]引物1：5′-GCATCAAGTACCACTGGT-3′；引物2：5′-GCATTAAGTACCACTGAG-3′；共通引物：5′-GAGAAGTTGAGAAAGGGGT-3′。模板DNA、Ta -
與直接原位PCR所不同的是，靶基因在擴(kuò)增時(shí)不進(jìn)行標(biāo)記基團(tuán)的摻入，而是標(biāo)記一段與擴(kuò)增片段互補(bǔ)的探針，在擴(kuò)增結(jié)束后，應(yīng)用此探針進(jìn)行原位雜交。因此，此處主要介紹原位雜交，其余方法同原位PCR。一、預(yù)雜交1.試劑與配制2×SSC50%去離子甲酰胺：用4×SSC配制（v/v）預(yù)雜交液：2×SSC，5%硫酸葡聚糖，50%甲酰胺，0.2%脫脂奶粉2.操作方法①在進(jìn)行完原位PCR擴(kuò)增后，用2×SSC預(yù)浸經(jīng)乙醇脫水、空氣干燥的玻片，并簡(jiǎn)洗15min；②用50%去離子甲酰胺37℃孵育15min；③加預(yù)雜交液20μl
