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1.離心(Centrifuge):高速離心(10,000rpm)20-30秒,或低速離心(2,000rpm)5分鐘。2.溶解(Reconstitution):用去離子水或其它緩沖液(根據說明書要求進行選擇)溶解至說明書要求的濃度(一般為0.1-1.0mg/ml)。溶解時不可振蕩,避免因化學鍵的斷裂造成蛋白失活,可加入適當?shù)娜軇┹p搖并靜置一段時間,待細胞因子*溶解后使用。溶劑的選擇:1)要求用去離子水溶解的產品,務必不可用鹽溶液,避免過高的鹽濃度造成蛋白不可逆的析出;2)要求用鹽溶液溶解的產品,請
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PeproTech公司的重組細胞因子產品經過了十分嚴格的生產、純化及質檢過程,保證其在投放市場之前,達到如下要求:1.真實性:重組蛋白產品一致經過N末端氨基酸序列分析;必要時應用SDS-PAGE,RP-HPLC和質譜(MS)檢測其真實性。2.純度:應用SDS-PAGE和RP-HPLC方法分析產品純度。3.生物活性:進行相應的體外(invitro)或體內(invivo)活性檢測。4.蛋白含量:通過紫外光譜分析,SDS-PAGE電泳檢測;必要時應用HPLC定量標準蛋白溶液。5.內毒素:kinetic
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福爾馬林固定時,組織中的許多氨基酸殘基在分子內或分子間形成了醛鍵,使得不少抗原決定簇被封閉。同時,由于甲醛的聚合作用,使蛋白質分子間相互交聯(lián)形成大分子網絡,也導致了抗原決定簇被掩蓋,這就使得相當部分的抗原不能與抗體很好是進行反應。因此,抗原修復也是影響免疫組化染色結果的基本因素??乖迯停ˋntigenretrieval,AR)技術,建立在Fraenkel-conrat等人[1]一系列生物化學研究,經1991年shi等人[2]發(fā)展。抗原修復是指石蠟、冰凍、火棉膠、塑料切片免疫組織化學(IHC)前
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RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是正常生物體內抑制特定基因表達的一種現(xiàn)象,它是指當細胞中導入與內源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)時,該mRNA發(fā)生降解而導致基因表達沉默的現(xiàn)象,這種現(xiàn)象發(fā)生在轉錄后水平,又稱為轉錄后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)。外源dsRNA進入細胞后產生的小分子干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)的反義鏈和多種核酸酶形
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細胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3'-OH末端,可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的作用下,將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端,從而可進行凋亡細胞的檢測,這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL)。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂,因而沒有3'-OH
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細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質發(fā)生濃縮,染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,形成50~300kbp長的DNA大片段,或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段,在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNAladder)。細胞經處理后,采用常規(guī)方法分離提純DNA,進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色,在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNAladder。如果細胞量很少,還可在分離提純DNA后,用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)使DNA標記,然后進行電泳和放射自顯影,觀察凋亡細胞中DNAlad
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線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用,多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發(fā)生凋亡,而線粒體跨膜電位的下降,被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應過程中zui早發(fā)生的事件,它發(fā)生在細胞核凋亡特征(染色質濃縮、DNA斷裂)出現(xiàn)之前,一旦線粒體DYmt崩潰,則細胞凋亡不可逆轉。線粒體跨膜電位的存在,使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine123、3,3-Dihexyloxacarbocyanineiodide[DiOC6(3)]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazolcarb
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磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)正常位于細胞膜的內側,但在細胞凋亡的早期,PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面,暴露在細胞外環(huán)境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白,能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行熒光素(FITC、PE)或biotin標記,以標記了的Annexin-V作為熒光探針,利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一種核酸染料,它不能