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PCR技術(shù)專題：分子標(biāo)記——AFLP原理和操作步驟
一、原理AFLP也是通過(guò)限制性內(nèi)切酶片段的不同長(zhǎng)度檢測(cè)DNA多態(tài)性的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)。但AFLP是通過(guò)PCR反應(yīng)先把酶切片段擴(kuò)增，然后把擴(kuò)增的酶切片段在高分辨率的順序分析膠上進(jìn)行電泳，多態(tài)性即以擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度不同被檢測(cè)出來(lái)。實(shí)驗(yàn)中酶切片段首先與含有與其共同粘末端的人工接頭連接，連接后的粘末端順序和接頭順序就作為以后PCR反應(yīng)的引物結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)需要通過(guò)選擇在末端上分別填加了1～3個(gè)選擇性核苷的不同引物，可以達(dá)到選擇性擴(kuò)增的目的。這些選擇性核苷酸使得引物能選擇性地識(shí)別具有特異配對(duì)順序 -
PCR技術(shù)專題：PCR-SSCP 技術(shù)實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)（PolymeraseChainReaction-SingleStrandConformationPolymorphism，PCR-SSCP）技術(shù)是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，它是一種簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)的用來(lái)顯示在PCR反應(yīng)產(chǎn)物中單堿基突變（點(diǎn)突變）的手段。該方法已被用做癌基因和抑癌基因突變的篩查檢測(cè)，遺傳病的致病基因分析和基因診斷，基因制圖等領(lǐng)域。在SSCP測(cè)定中，雙鏈DNA（dsDNA）被變性成為單鏈DNA（ssDNA），每一條單鏈DNA都基于它們的內(nèi)部序 -
PCR技術(shù)專題：直接原位PCR（In situ PCR）
原位PCR是原位雜交細(xì)胞定位和PCR的高靈敏度相結(jié)合的技術(shù)，使得靶基因檢測(cè)有了極大的改進(jìn)。此技術(shù)是在細(xì)胞（爬片、甩片或涂片）或組織（石蠟、冰凍切片）上直接對(duì)靶基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)摻入標(biāo)記基團(tuán)直接顯色或結(jié)合原位雜交進(jìn)行檢測(cè)的方法。一、組織切片和細(xì)胞樣品的制備試劑與配置10%福爾馬林；二甲苯；PBS操作方法1.用10%福爾馬林固定組織8~15hr，石蠟包埋，切片（4μm），將切片置于新鮮的二甲苯中處理5min，放入無(wú)水乙醇中浸泡5min，取出，空氣干燥；2.對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞，可直接制備爬片，也可有PB -
PCR技術(shù)專題：實(shí)時(shí)熒光定量PCR具體實(shí)驗(yàn)步驟
1樣品RNA的抽提①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。②兩相分離每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。③RNA沉淀將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育 -
PCR技術(shù)專題：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物克隆
PCR（PolymeraseChainReaction，聚合酶鏈反應(yīng)）是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA的方法.它包括三個(gè)基本步驟：（1）變性（Denature）：目的雙鏈DNA段在94℃下解鏈；（2）退火（Anneal）:兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度（50℃左右）下與模板上的目的序列通過(guò)氫鍵配對(duì)；（3）延伸（Extension）:在TaqDNA聚合酶合成DNA的zui適溫度下，以目的DNA為模板進(jìn)行合成。由這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán)，理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍，這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA -
PCR技術(shù)專題：逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法
逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR）的原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。一、反轉(zhuǎn) -
PCR技術(shù)專題：PCR技術(shù)原理、實(shí)驗(yàn)步驟和應(yīng)用
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的原理。2.掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）是由美國(guó)PECetus公司的KaryMullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）建立的。這項(xiàng)技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時(shí)反應(yīng)就將特定的DNA段擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。它不僅是DNA分析zui常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達(dá) -
轉(zhuǎn)染專題：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)方法
摘要：本實(shí)驗(yàn)介紹了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的幾個(gè)方法。實(shí)驗(yàn)原理脂質(zhì)體（LR）試劑是陽(yáng)離子脂質(zhì)體DOTMA和DOPE的混合物（1：1）。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前條件下zui方面的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。用LR進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，首先需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)找出該批LR對(duì)轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合的用量、作用時(shí)間等，對(duì)每批LR都要做。先要固定一個(gè)DNA的量和DNA/LR混合物與細(xì)胞相互作用的時(shí)間，DNA可從1-5ug和孵育時(shí)間6h，開(kāi)始，
