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感受態(tài)專題：感受態(tài)細(xì)胞的制備及溶液配制
實(shí)驗(yàn)試劑LB培養(yǎng)基，KB培養(yǎng)基，10%甘油，液氮，0.1MCaC12溶液實(shí)驗(yàn)設(shè)備超凈工作臺(tái)，搖床，離心機(jī)，250mL離心瓶，0.5mL的離心管實(shí)驗(yàn)材料大腸桿菌，農(nóng)桿菌和假單胞桿菌實(shí)驗(yàn)步驟1.電擊感受態(tài)細(xì)胞的制備1）-80℃保存的大腸桿菌，農(nóng)桿菌或者假單胞桿菌在固體平板上（DH，BL21在LB平板上，GV3101在LB/Gen;P.s.pv.tomato0288-9和P.syringaepv.tabaci6505在KB平板上）劃線。2）接種單克隆于5-10mL液體培養(yǎng)基，37℃（大腸桿菌）或者28 -
感受態(tài)專題：真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟
1.在6孔板中接種1~3×105細(xì)胞/孔，加入2ml*培養(yǎng)基，置CO2孵箱中37℃培養(yǎng)過。2.待細(xì)胞長到50-80%單層時(shí)，在無菌離心管中配制如下溶液：i.溶液A：將4?g待轉(zhuǎn)染的超純DNA稀釋到250?l無血清培養(yǎng)基中，靜置5minii.溶液B：將2-25?lLipofectAMINE稀釋到250?l無血清培養(yǎng)基中，靜置5min3.混合溶液A和B，輕輕混勻，室溫放置15-45min。4.用2ml無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌細(xì)胞，加入0.8ml無血清培養(yǎng)基/孔，將脂質(zhì)體復(fù)合物滴加到孔中，輕輕搖晃混勻，置 -
1．目的學(xué)會(huì)用酶切法或PCR法篩選重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功的克隆菌。2．原理利用轉(zhuǎn)化后宿主菌所獲得的抗菌素抗性性狀篩選出獲得質(zhì)粒的菌落克隆。再從這些菌落中鑒定出質(zhì)粒上帶有外源基因插入片斷的克隆菌落。3．器材旋渦混合器，小鑷子，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯?，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，超凈工作臺(tái)，酒精燈，無菌牙簽，搖菌管。4．試劑LB培養(yǎng)基（加抗菌素），PCR用試劑，引物，質(zhì)粒提取用試劑，酶切需要的限制性內(nèi)且酶及其緩沖液，65%甘油（65%甘油，0
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感受態(tài)專題：細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
原理：通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法及電穿孔等基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將靶基因?qū)爰?xì)胞，一般在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)左右，靶基因即可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?8小時(shí)后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用：觀察目的基因及其表達(dá)蛋白在某種細(xì)胞中的功能（短時(shí)間即可進(jìn)行觀察，但效應(yīng)會(huì)很快丟失）。一般流程：1）細(xì)胞接種：轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前天接種細(xì)胞，各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的生長率和細(xì)胞形狀而定。進(jìn)行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞密度應(yīng)達(dá)到60%~80%覆蓋。2）細(xì)胞轉(zhuǎn)染（脂質(zhì)體、電穿孔、FuGENE6等）3）48小時(shí)以后鑒定目的基因的表達(dá)情 -
一、電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備1.用槍頭挑取單克隆菌落，投入盛有10mlLB液體培養(yǎng)基的50ml離心管中。（同時(shí)做培養(yǎng)基和槍頭的空白對(duì)照）2.37℃，220rpm，培養(yǎng)14-16個(gè)小時(shí)。3.第二天，以1：100的比例將這10ml菌液倒入1000mlLB液體培養(yǎng)基中，37度，220rpm，振搖2-3小時(shí)，每半小時(shí)測(cè)一次OD，當(dāng)OD值達(dá)到0.3-0.4時(shí)，停止培養(yǎng)。4.將菌液在冰上預(yù)冷30分鐘，隨后將菌液分裝到500ml預(yù)冷的離心杯中，4℃，2500rpm離心10分鐘。5.棄上清，離心杯中加入少量ddH
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感受態(tài)專題：電穿孔轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli TG1細(xì)胞的制備
材料和試劑1.恒溫旋轉(zhuǎn)式搖床2.三角燒瓶（容量為1或2L）3.50ml滅菌離心管4.低溫高速離心機(jī)5.SB培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨20g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5gNaCl0.5g去離子水950ml250mmol/LKCl溶液10ml以5N的NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.0，加去離子水至1L，高壓蒸氣滅菌。6.20%葡萄糖溶液7.1mol/LMgCl2溶液8.10%甘油操作步驟1.從新鮮的LB平板培養(yǎng)物中挑選一個(gè)TG1克隆，接種于10m1SB培養(yǎng)基中。2.37℃搖床培養(yǎng)過。3.取2.5ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn) -
感受態(tài)專題：磷酸鈣法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞
一.試劑配制無菌水ddw：高溫滅菌；分裝；2XHBS：280mMNaCl10mMKCl1.5mMNa2HPO412mMglucose50mMHEPESAdjustthepH,every0.05pHfrom7.00to7.45using10NNaOH,thenaddddw.tothefinalvolume.過濾滅菌，分裝；2MCaCl2：過濾滅菌，分裝。二.實(shí)驗(yàn)過程：1.鋪細(xì)胞：選擇狀態(tài)良好的293T細(xì)胞傳代，2-3x105個(gè)細(xì)胞/35mmdish。2.20-24h后，待細(xì)胞長至鋪滿瓶底約50-7 -
專題：原核表達(dá)（原理、材料與實(shí)驗(yàn)方案）
一、原理1、E.coli表達(dá)系統(tǒng)E.coli是重要的原核表達(dá)體系。在重組基因轉(zhuǎn)化入E.coli菌株以后，通過溫度的控制，誘導(dǎo)其在宿主菌內(nèi)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，將表達(dá)樣品進(jìn)行SDS-PAGE以檢測(cè)表達(dá)蛋白質(zhì)。2、外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)提高外源基因表達(dá)水平的基本手段之一，就是將宿主菌的生長與外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，以減輕宿主菌的負(fù)荷。常用的有溫度誘導(dǎo)和藥物誘導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)采用異丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。不同的表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)方法并不*相同，因啟動(dòng)子不同，誘導(dǎo)表達(dá)要根據(jù)具體情況而定。二
